一种dna编码化合物库药物分子垂钓方法
技术领域
本发明属于药物筛选
技术领域
，具体涉及一种DNA编码化合物库药物分子垂钓方法。背景技术
分子垂钓(Molecule Fishing)是一种基于药物靶点与活性分子的相互作用，从复杂的生物样品中亲和选择配体，以实现先导化合物的发现的高通量生物分析方法，具有特异性强、效率高、对样品预处理要求少等特点，是传统高通量筛选方法(High ThroughputScreening,HTS)基础上的重要技术进步。一般由靶标固定化(酶、细胞等)、亲和垂钓、配体洗脱与LC-MS分析4个部分组成。分子垂钓技术包括离线模式的分子垂钓技术和在线模式的分子垂钓技术。在离线模式的分子垂钓中，亲和垂钓和配体结构分析是独立进行的，分子垂钓对设备和技术的要求相对较低，因此广泛应用于实验室的配体筛选实验，包括亲和超滤法、磁性纳米粒子垂钓法、中空纤维分离法。而在在线模式的分子垂钓技术中，亲和分离和配体结构分析是同时进行的，与离线模式相比具有高自动化程度、高简便性、高灵敏性的特点。同时，亲和分离和配体结构分析的同步进行可以实现在线动态监测，获取组分与靶标的相互作用动力学参数，有助于探究和改进实验机制，包括生物亲和色谱法、毛细管电泳法、BIA技术。
其中，基于表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)的生物分子相互分析(Biomolecular Interaction Analysis,BIA)技术是一种新型生物传感技术。由此技术开发出的生物传感仪器商品名为Biacore，主要包括SPR光学检测系统、微射流卡盘、传感器芯片3个核心部分。分析时，将一种生物分子耦联在传感芯片表面，再将另一种与之发生相互作用的生物分子溶液注入SPR光学检测系统中，流经传感芯片表面与耦联在传感芯片上的生物分子相结合，芯片表面物质质量增加，折射率发生变化，通过SPR响应值可实时监测生物分子间的相互作用变化。Biacore不需要使用荧光标记和同位素标记，直接通过表面等离子共振的物理光学现象，测量其光学反射率的变化，实时追踪生物分子间相互作用的方法，具有极高的灵敏度、分辨率和特异性。然而，Biacore技术对样品要求高，对样品量耗费巨大，具有明显的局限性。
在当代新药开发领域，针对生物靶点建立大规模的候选药物分子库进行高通量筛选是新药研发中获得先导化合物不可或缺的手段之一，当今世界上大型制药公司均具有自己大规模的分子库和筛选平台。然而，基于单分子的高通量筛选所需成本高，实验设备昂贵，管理运行复杂，时间跨度大，合成的化合物有限且单一，极大地限制了先导化合物的发现效率。近年来，随着高通量技术的不断发展，DNA编码化合物库(DNA Encoding ChemicalLibrary,DEL)技术逐渐成为药物研发领域的新兴筛选方法。DEL筛选的原理是将一段特异性DNA序列与一个小分子化合物在分子水平上连接，DNA序列作为小分子的标记序列，使每一个反应中的小分子对应独一无二的DNA片段。通过对目标化合物连接的独特DNAbarcodes进行PCR扩增与测序，挑选出所需小分子化合物的结构信息。它可以实现在极小的体系中完成千亿级别高通量的筛选，极大地提高了先导化合物的发现效率，是新药研发的重要手段之一。然而，传统的DEL只对单一蛋白靶点发生作用，不能在蛋白互作水平上发挥作用。随着人们对癌症靶向抑制的研究，只针对单一靶点的药物筛选显然不能满足蛋白互作机制的需要。
表面增强的拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Spectroscopy,SERS)是基于物理增强和化学增强的一种信号增强技术，被广泛应用于生物医学领域，如核酸、蛋白质、细胞、组织等的检测。它基于金属附在粗糙分子表面或位于金属材料间隙或尖端时放大由局部表面等离子体激发产生的电磁场，使吸附在金属表面上待测物的拉曼信号增强103-106倍，对低浓度分析物进行高灵敏检测。SERS技术可以在液体环境下提供超高敏感性被测物的固有分子指纹信息，特异性强、灵敏度高，可以准确而灵敏地检测到蛋白质的特征峰，当小分子化合物影响蛋白质互作时，特征峰值又会出现明显改变，因此在药物高通量筛选方面有着重大意义。目前尚没有将DEL与SERS相结合进行分子垂钓并应用在小分子药物筛选中的报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种小分子化合物的分子垂钓方法，将分子垂钓与DEL相结合，通过表面增强的拉曼散射对于影响目标蛋白互作的小分子进行高灵敏度、高特异性的高通量筛选。
本发明提供了一种靶向药物的高通量筛选方法，包括以下步骤：
步骤S1，将第一段化合物分别与第一段DNA片段耦联，混合后分散，将耦联后化合物分别与第二段分子砌块及第二段DNA片段连接，两段DNA片段等温扩增后混匀，得到DNA编码的化合物库；
步骤S2，制备金属纳米粒子探针与靶蛋白或靶蛋白结合受体蛋白耦联，加入所制备DNA编码化合物库中，孵育，进行分子垂钓，通过PCR扩增与DNA测序获得靶向药物信息；
步骤S3，分别制备金属纳米粒子探针和磁珠探针并与拉曼信号分子耦联，再将金属纳米粒子探针或磁珠探针分别与靶蛋白或靶蛋白结合受体蛋白耦联，加入筛选出的化合物；
步骤S4，检测拉曼信号，判断所筛选出的化合物是否具有抑制靶蛋白与靶蛋白受体结合的作用。
在某些实施例中，所述金属纳米粒子探针为金纳米粒子探针或银纳米粒子探针。
在某些实施例中，所述拉曼信号分子为4-MBA或4-ABP。
在某些实施例中，所述结合受体为具有能够与靶蛋白或核酸结合活性的受体蛋白。
在某些实施例中，所述结合受体为KRAS-PDEδ蛋白。
在某些实施例中，所述步骤S5中的判断具体为：
若检测到SERS信号明显由强变弱或由弱变强，则所述待筛选化合物为针对特定靶点的靶向药物；
若SERS信号没有明显改变，则所述待筛选化合物非针对特定靶点的靶向药物。
在某些实施例中，所述方法还包括设置阳性对照，所述阳性对照为已知具有抑制靶蛋白与靶蛋白结合受体结合活性的抑制剂。
在某些实施例中，所述抑制剂可以为小分子化合物、蛋白质或核酸。
在某些实施例中，所述方法还包括对靶向药物的回收。
本发明还提供了本发明上述的高通量筛选方法在在混合物中进行分子垂钓得到靶向药物的应用。
本发明相对与现有技术具有的效果：
1)本发明首次将拉曼信号检测与DNA编码化合物库结合应用到基于分子垂钓的抑制剂筛选技术领域，在蛋白互作水平上发生作用，形成简单灵敏的抑制剂筛选方法。
2)本发明的方法成本低，测量干扰小，信号强且灵敏度高，可检测低丰度蛋白质，并可以实现高通量分子垂钓，同时操作简便，整个检测过程无需进行清洗，检测后样品库可重复利用，为抑制剂的筛选途径提供了新策略。
3)本发明所需样品量极微，相对于分子垂钓领域现有的Biacore技术，本发明仅需其万分之一的用量，显著地节约了样品成本，达到了在极小体系中筛选药物的目的。
4)本发明联合DEL进行分子垂钓，传统的分子垂钓只能在单一蛋白水平上发生作用，所得结果假阳性高；而本发明基于分子垂钓的药物筛选由于能在蛋白互作水平上发生作用而更广泛地运用于疾病靶向药物的研究，具有明显的优势性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中DNA编码化合物库的建立过程示意图。
图2为实施例2，3，4中分子垂钓和SERS检测过程示意图。
图3为实施例5中用CCK8试剂盒检验Deltarasin对Hep3B肿瘤细胞具有明显的体外杀伤作用。
图4为实施例5中用CCK8试剂盒检验D1350124对Hep3B肿瘤细胞具有明显的体外杀伤作用。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。
实施例1 DNA编码化合物库的制备
1、寡核苷酸-化合物连接反应
取一种化合物(1.25μmol)溶解于DMSO中稀释到230μL,加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(12μL 100mM溶于DMSO)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(10μL330mM溶于DMSO/H2O2:1)30℃活化20分钟后，加入三乙胺(TEA)/HCl(50μL 500mM pH 10.0)及相对应的寡核苷酸(30μL 500μM)30℃搅拌过夜。加入Tris-HCl(20μL,500mM,pH 8.0)30℃搅拌1h终止反应后，加入三乙胺乙酸(TEAA)(500μL,100mM,pH 7.0)。HPLC纯化后减压干燥，100μLH20重新溶解后，用紫外分光光度计进行浓度质检及LC-ESI-MS进行质检。用上述方法共连接40种不同寡核苷酸-化合物。寡核苷酸的结构为5’-H2N-(CH2)12-GGA GCT TGTGAA TTC TGG NNN NNN NNN GGA CGT GTG TGA ATT GTC-3’，其中NNN NNN NNN代表与化合物相对应连接的核苷酸碱基，示例性列举5种化合物及DNA片段，具体信息如表1所示。将上述化合物混合后等分成200份。
表1第一化合物种类及第一DNA片段
2、连接第二个化学分子砌块
200个分子砌块均含有亚甲基羧酸结构，示例性列举5种如表2所示。
表2第二化合物种类及第二DNA片段
将DEAE琼脂糖树脂(100μL)转移至SpinX柱，用水(0.8mL)和乙酸(0.8mL,10mM,pH5)洗涤后，树脂用乙酸(200μL,10mM,pH 5)重悬，加入一等份寡核苷酸-化合物(360pM)，孵育15min固定在树脂上。溶液转移至Glen Research column并用乙酸(1mL,10mM)和甲醇(MeOH 2mL)洗涤。与树脂结合的寡核苷酸-化合物加入新鲜配制的EDC-HCl(50mM,500μL)和乙酸(5mM)，将一份50mM亚甲基羧酸溶于二甲基甲酰胺(DMF)/MeOH 3:2中，流速25μLmin-1反应20min。亚甲基羧酸共经EDC-HCl活化六次，即在流速25μLmin-1总共反应120min。柱子用MeOH(3mL)和乙酸(1mL,10mM)洗涤，DEAE琼脂糖树脂溶液用乙酸(400μL,10mM)重悬，转移至SpinX column中6,000rpm离心1min。DEAE琼脂糖树脂溶液用乙酸钠缓冲溶液(400μL,1M,pH 8.7)重悬，孵育2min，13,200rpm稍作离心，洗脱液中寡核苷酸-化合物产量5％。DEAE琼脂糖树脂溶液用乙酸钠/乙酸缓冲液(200μL,3M,pH 4.7)，孵育2min，13,200rpm离心1min，洗脱液中寡核苷酸-化合物产量50％。向该洗脱液中加入EtOH(1.8mL)，-20℃孵育过夜。样本4℃条件下离心20min(13,200rpm)，剩余DNA用85％EtOH洗涤后，4℃条件下离心20min(13,200rpm)，去除上清，样本用旋转真空浓缩器干燥，溶解于50μL水中并用紫外质检浓度。
3、Klenow聚合酶编码第二段寡核苷酸片段
寡核苷酸共200份，其结构为：5’-GTA GTC GGA TCC GAC CAC NNNN NNNN GAC AATTCA CAC ACG TCC-3’,其中NNNN NNNN代表与相应化合物连接的寡核苷酸。将步骤1中获得的修饰过的寡核苷酸-化合物次级库(16pM)与相应第二段寡核苷酸片段(24pM)溶解于Klenow polymerase buffer至终体积44μL，其中第二段寡核苷酸片段如表2中所示。反应混合物50℃条件下孵育10min，冷却至室温使两片段局部互补连接。加入dNTP(5μL 33μM)，Klenow polymerase(5U)25℃反应30min。反应用离子交换柱纯化后用QE buffer(50μL)洗脱。每个次级库120μL混合产生DNA编码化合物库DEL8000，终浓度为360nM，-20℃贮存。
实施例2分子垂钓
合成银纳米离子探针(AgNPs)：取一只250mL三口烧瓶在酸缸浸泡过夜，第二天取出冲洗干净后再用注射用水洗涤三次，保证壁内纯净无杂质。放入烘箱烘干，冷却至室温。期间精确称量0.018g硝酸银粉末，小心倒入三口烧瓶中。加入100mL超纯水，摇匀，接上冷凝管并设定电热套温度为100℃，将溶液搅拌加热至微沸后立刻快速加入2mL 1％的柠檬酸钠溶液。观察溶液颜色变化：浅黄，到深黄，再到灰绿，观察到颜色不再发生变化，稍稍降温到90℃，继续磁力搅拌，维持40min得到银纳米粒子分散体系。用紫外分光光度计测定银纳米粒子的吸光度曲线：将银纳米粒子5倍稀释后检测，观察最大吸收波长范围(420-480nm)正确，并没有其他杂峰，即可初步判断合成粒径均一。利用公式：A＝kbc(A＝Amax,k＝3×1011M-1cm-1,b＝1cm)计算银纳米粒子的浓度。4℃保存备用。
浓缩AgNPs为0.29nM以上，加入新鲜配制的吐温20，反应30min后加入5.0μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(2.5mM)和5.0μL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(2.5mM)，反应1h，离心去除多余的活化剂，重悬浮。加入5μL Domain Z(0.05mg/mL)反应2h，离心后洗涤，加入3μL PDEδ(0.05mg/mL)耦联过夜，离心后洗涤一次，加入DEL8000中耦联过夜，离心后去上清，用1％乙酸(500μL)重悬沉淀，37℃快速振荡，至明显银镜反应析出，取上清离心，再取上清作为待测样品。
实施例3化合物结构确定
根据化合物连接的寡核苷酸片段通过PCR扩增和DNA测序确定DNA片段的信息，从而获得化合物结构信息。
取1μL上清液作为模板，加入10μM引物(引物结构分别为5’-GCC TCC CTC GCG CCATCA GGG AGC TTG TGA ATT CTG G-3’(SEQ ID NO.11),5’-GCC TTG CCA GCC CGC TCA GGTAGT CGG ATC CGA CCA C-3’(SEQ ID NO.12))4*2mM dNTP，1.25U Taq酶及PCR buffer。PCR步骤为：DNA 94℃变性2min，94℃40s 4个循环，54℃40s，72℃40s，94℃40s 30个循环，64℃30s，72℃30s，72℃7分钟。反应结束后,将相应样品混合后用离子交换柱纯化，50μL QEbuffer提取。
根据PCR扩增和DNA测序结果确定DNA片段的信息，从而获得连接的化合物为对应的D1350124号化合物及化合物结构信息。根据以上技术流程我们可以实现对化合物库的垂钓，并获得化合物结构信息。
实施例4表面增强的拉曼光谱检测
1.制备金(银)纳米粒子
1.1制备金纳米粒子
金纳米粒子(AuNPs)：取一只250mL三口烧瓶，用王水(1份浓硝酸加入3份浓盐酸)清洗，第二天取出冲洗干净后再用注射用水洗涤三次，保证壁内纯净无杂质。放入烘箱烘干，冷却至室温。烧瓶中加入2mL 1％的HAuCl4加水至200mL，接上冷凝管，用电热套加热至150℃，搅拌加热回流至微沸。加入2mL 1％柠檬酸钠，控制温度，观察颜色变化，从淡黄色到黑色(110℃-120℃)，再到红色(90℃)，降温至90℃，保持该温度40min，得到金纳米粒子分散体系。
1.2制备银纳米粒子
银纳米粒子(AgNPs)：取一只250mL三口烧瓶在酸缸浸泡过夜，第二天取出冲洗干净后再用注射用水洗涤三次，保证壁内纯净无杂质。放入烘箱烘干，冷却至室温。期间精确称量0.018g硝酸银粉末，小心倒入三口烧瓶中。加入100mL超纯水，摇匀，接上冷凝管并设定电热套温度为100℃，将溶液搅拌加热至微沸后立刻快速加入2mL 1％的柠檬酸钠溶液。观察溶液颜色变化：浅黄，到深黄，再到灰绿，观察到颜色不再发生变化，稍稍降温到90℃，继续磁力搅拌，维持40min得到银纳米粒子分散体系。用紫外分光光度计测定银纳米粒子的吸光度曲线：将银纳米粒子5倍稀释后检测，观察最大吸收波长范围(420-480nm)正确，并没有其他杂峰，即可初步判断合成粒径均一。利用公式：A＝kbc(A＝Amax，k＝3×1011M-1cm-1，b＝1cm)计算银纳米粒子的浓度。4℃保存备用。
2.磁纳米粒子的制备
百迈格生产的商品化羧基磁珠，配置浓度为0.5mg/mL，用磁珠保存液冲洗并磁分离重复三次，重悬在保存液中以防止磁珠聚集，于4℃保存备用。
3.合成KRAS-PDEδ蛋白抑制剂筛选相关的两种拉曼探针(拉曼信号分子偶联在银纳米粒子上)
偶联蛋白时为了减少与非位点特异性结合，提高蛋白的靶向效率，我们在PDEδ蛋白的C端添加了一段Fc标签并使用Protein A结构域B高效特异性的识别PDEδ的Fc段。
1mL AgNPs(0.25nM)加入20μL吐温20混匀20min防止AgNPs聚沉。然后，加入10μL2.5mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和10μL 2.5mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)混匀活化1小时，离心(3500g,6min)，吸去上清后用等体积的注射用水将AgNPs重悬。迅速加入4μL Domain B(0.05mg/mL)偶联1.5小时，离心(3500g,6min)，吸去上清后用等体积的注射用水将AgNPs重悬。用拉曼信号分子4-巯基苯甲酸(4-Mercaptobenzoic acid,4-MBA)组装到AgNPs表面，加入2μL PDEδ(0.05mg/mL)和25μl 4-MBA(1.0mM)偶联1.5小时，离心(3500g，6min)，吸去上清后用等体积的注射用水将AgNPs重悬得到AgNPs4-MBA @Domain [email protected]δ探针。
加入1μL乙醇胺(15mM)和1μLBSA(0.5mg/mL1)封闭20min,离心(3500g,6min)，吸去上清后用等体积的注射用水将AgNPs重悬。
为了完成KRAS4B和磁珠的偶联，合成一段生物素化C端K-Ras4B多肽，与链霉亲和素修饰的磁珠(300nm,0.5mg/mL)偶联。
Deltarasin(一种小分子KRAS-PDEδ抑制剂)作为阳性药。在有Deltarasin(2.0μL，5μg/mL)和没有Deltarasin的情况下混合两种探针(银探针：磁探针＝500μL：150μL)，分别对两组混合物进行磁分离，用注射用水洗涤磁探针3次后用等体积注射用水重悬。
磁富集后，在633nm的激发光下进行SERS检测，可以看到明显的拉曼信号变化，加入阳性药后，拉曼信号明显降低。阳性药浓度越高，信号峰越低。
加入D1350124号化合物(2.0μL，5μg/mL)的情况下混合两种探针(银探针：磁探针＝500μL：150μL)，对混合物进行磁分离，用注射用水洗涤磁探针3次后用等体积注射用水重悬。磁富集后，在633nm的激发光下进行SERS检测，可以看到明显的拉曼信号变化，加入D1350124号化合物后，拉曼信号明显降低。D1350124浓度越高，信号峰越低。
实施例5细胞杀伤实验检验D1350124号化合物
用CCK8试剂盒检验Deltarasin和D1350124都对Hep3B肿瘤细胞具有明显的体外杀伤作用。结果如图3、4显示，Deltarasin和D1350124孵育48小时后，Hep3B细胞的数量变化，且细胞体外杀伤作用具有计量依赖性，随着药物浓度增加，杀伤作用明显增强。
从分子和细胞水平都证明，通过基于表面增强拉曼光谱联合DNA编码化合物库进行药物分子垂钓的技术方法的可行性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学
<120> 一种DNA编码化合物库药物分子垂钓方法
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