一种用于纳米孔测序的磷脂双层膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物科学
技术领域
，具体涉及一种用于纳米孔测序的磷脂双层膜及其制备方法。背景技术
DNA是构成生命的密码和蓝图。DNA中的核苷酸中碱基的排列顺序构成了遗传信息，该遗传信息可以通过转录过程形成RNA，然后其中的mRNA通过翻译产生多肽，形成蛋白质。DNA甲基化作为一种相对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制；因此，作为哺乳动物体内唯一存在的甲基化形式，5-甲基胞嘧啶也被称为人体的“第五碱基”，异常的DNA甲基化与多种疾病的发生和发展有着密切关系。因此，准确检测人体DNA上碱基排布序列及其甲基化情况将为人类预测各种疾病提供强有力的证据。
基因测序技术是一项能够测定核酸或氨基酸等生物分子序列的新兴技术。如今，测序仪器虽几经迭代，然而前三代技术，都具有各自难以克服的重大缺陷，从而催生出第四代基因测序仪来满足人类对基因测序的更高要求。第四代基因测序技术又称纳米孔测序技术，其原理是在电场力作用下，单链核酸分子在通过纳米孔通道时，不同碱基产生不同的电流信号，通过观测这种电信号的差异便能识别出核酸分子中的DNA序列分布。相比于前面三代测序技术，第四代测序技术是真正实现单分子检测和电子传导检测相结合的测序方法，具有超高读长、高通量、更少的测序时间和更为简单的数据分析，实现了从低读长到超高读长、从光学检测到电子传导检测的双重跨越。然而，人工双层磷脂膜作为纳米孔测序技术中不可或缺的一部分，目前仍然没有一个可稳定重复的制备方法，严重拖慢了第四代基因测序仪投入市场的进程。因此，开发具有高重复性和稳定性的新型人工双层膜的制备方法，将会是一项极具技术意义和市场意义的发明。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种用于纳米孔测序的磷脂双层膜及其制备方法，利用带双键的疏水性小分子单体与磷脂进行掺杂并进行原位聚合，以解决现有技术中磷脂双层膜稳定性差和难以重复制备等问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种用于纳米孔测序的磷脂双层膜的制备方法，依次包括以下步骤：
(1)将疏水性小分子单体、光引发剂和磷脂分子混合，得磷脂混合物；
(2)将磷脂混合物涂抹至纳米孔基材上，溶剂挥发，得磷脂膜；
(3)在纳米孔基材两侧浴池中加入离子缓冲液使磷脂分子复溶，然后在纳米孔基材上复涂磷脂混合物，光引发聚合，得用于纳米孔测序的磷脂双层膜。
进一步，步骤(1)中，疏水性小分子单体和磷脂分子摩尔比为1:1-10。
进一步，步骤(1)中，疏水性小分子单体和光引发剂摩尔比为1-10:1。
进一步，步骤(1)中，疏水性小分子单体为甲基丙烯酸2-乙基己酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟乙酯、N,N-二乙基丙烯酰胺、3-(二甲氨基)丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和2-羟丙基甲基丙烯酰胺中的至少一种。
进一步，步骤(1)中，光引发剂为2,2-二乙氧基-1-苯己酮、а-甲基苯基巯基二苯甲酮或三甲基甲酰二苯基氧化膦。
进一步，步骤(2)中，磷脂分子为二植酰磷脂酰胆碱。
进一步，步骤(2)中，采用静置蒸发或氮气蒸发进行溶剂挥发。
进一步，步骤(2)中，纳米孔基材通过以下方法制备得到：选取聚苯乙烯或聚碳酸酯为基底材料，进行SU-8预处理，然后以全氟辛基三氯硅烷为改性材料进行环氧开环活化，得纳米孔基材。
进一步，步骤(3)中，离子缓冲液为0.1M氯化钾溶液和5mM HEPES溶液的混合液，pH值为7.4。
进一步，步骤(3)中，光引发聚合时，在波长254-365nm和功率5-50W紫外光下照射10min-2h，辐照温度为4-37℃。
进一步，制备的磷脂膜应包括以下几类：
将固体二植酰磷脂酰胆碱用氩气体干燥后真空过夜，随后将其溶解于正癸烷中，用该溶液制备常规非聚合的磷脂双层膜(BLMs)。
进一步，疏水性可聚合小分子单体掺杂入的磷脂溶液中，在没有紫外光聚合的情况下，使用DPhPC(二植酰磷脂酰胆碱)、疏水性可聚合小分子单体和光引发剂的混合物制备混合非聚合的磷脂双层膜(MA-BLMs)。
进一步，将聚合物单体和光引发剂与DPhPC溶液混合后在纳米孔上成膜，经紫外光照射交联制备聚合的磷脂双层膜(PS-BLMs)。
进一步，上述MA-BLMs和PS-BLMs的制备具体步骤如下：
使用氧化铝柱除去聚合物单体中的自由基抑制剂后，将其与光引发剂DEAP以一定的比例混合，得到单体混合物；
向单体混合物中加入一定比例的DPhPC，搅拌5min得到单体掺杂的磷脂混合物，并将其溶入正癸烷中，最终磷脂浓度为20mg/mL；
将2μL的磷脂或磷脂/单体混合溶液涂抹至纳米孔上，并用氮气气体干燥，形成BLM；
在纳米孔两侧浴池中分别加入1mL缓冲液(1M KCl，5mM HEPES，pH 7.4)使磷脂或磷脂/单体混合物复溶，并通过盐桥连接到参比电极；
利用移液枪吸取微量磷脂或疏水性可聚合小分子掺杂的磷脂溶液后，在纳米孔周围反复轻扫成膜；通过监测纳米孔两侧电阻的增加，以确定BLM的形成。
进一步，磷脂双分子层内部聚合物稳定支架可以通过以下方式形成：
S1：用紫外灯在距BLM 1-2cm的地方进行紫外照射，使单体掺杂的磷脂混合物发生光交联，最终形成PS-BLM；
S2：通过测量击穿电压和寿命来表征BLMs的稳定性。击穿电压值是BLMs发生不可逆破裂的电位，通过施加从0到2000mV的递增电位，以10mV为增量，持续50ms，得到磷脂膜的击穿电压值，平均击穿电压值反映了BLM的电稳定性。磷脂膜寿命是指在±5mV 20Hz方波作用下，双层膜破裂所需的平均时间；
S3：选取短杆菌肽A(Granicidin A)或溶血素(α-HL)作为跨膜蛋白，将2μL的α-HL溶液(1mg/mL)加入纳米孔一侧装有1mL缓冲液的浴池中，在+40mV的偏置电位下将蛋白嵌入磷脂膜中，通过监测纳米孔两侧电阻的变化，以确定蛋白是否成功嵌入。
根据上述的用于纳米孔测序的磷脂双层膜的制备方法制得的用于纳米孔测序的磷脂双层膜。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明利用带双键的疏水性小分子单体与磷脂进行掺杂并进行原位聚合，以解决现有技术中磷脂双层膜稳定性差和难以重复制备等问题。在制备时，将疏水性小分子、引发剂和无聚合能力的二植酰磷脂酰胆碱(DPhPC)混合，由于此类小分子单体具有疏水性，因此能够聚集在脂质双分子层的“尾足”片层，随后利用紫外光照射对磷脂膜进行原位聚合，从而获得具有高稳定性和高离子通道活性的人工双层膜。
2、选取聚苯乙烯或聚碳酸酯作为基底材料，并对基底材料做SU-8预处理，从而为基材提供一个水接触角约为85°的非极性表面，更加适用于形成脂质双分子层。选取全氟辛基三氯硅烷作为改性材料，通过对SU-8预处理后的基材进行环氧开环活化，随后将全氟化物接枝到基材上，从而获得一个具有更强疏水性的的改性基底，以增强基材与磷脂分子之间的亲疏水作用效果，使磷脂分子在改性基材表面成膜更加稳定。
3、本发明创造性的在磷脂分子中引入疏水性可聚合单体，通过紫外交联在磷脂双分子层内部构筑一个聚合物稳定支架以提高磷脂膜的成膜稳定性，该方法具有极好的重复性，能够很大程度的提升纳米孔上磷脂膜的稳定性，以支持基因测序工作能够更加稳定、持久的进行。
具体实施方式
实施例1
一种用于纳米孔测序的磷脂双层膜，其制备方法依次包括以下步骤：
S1：取经SU-8预处理后的聚碳酸酯作为纳米孔基底，并用全氟辛基三氯硅烷对其进行氟化改性处理，得到疏水性更强的纳米孔基材；
S2：将EHMA和TEGDMA中的自由基抑制剂通过氧化铝柱去除，随后，将其和光引发剂2,2-二乙氧基-1-苯己酮(DEAP)按1:1:1的摩尔比混合，得到单体混合物，然后将单体混合物与等摩尔量的二植酰磷脂酰胆碱(DPhPC)两性磷脂分子混合溶于生理盐水中，得到单体掺杂的两性磷脂分子溶液。
S3：将单体掺杂的两性磷脂分子溶液涂抹至改性纳米孔上，并用氮气气体干燥；
S4：在纳米孔两侧各加入1mL缓冲液使涂附在纳米孔上的磷脂分子复溶；
S5：利用移液枪吸取微量单体掺杂的两性磷脂分子溶液在纳米孔周围复涂成膜；
S6：在距磷脂双层膜1-2cm的位置对磷脂膜进行UV辐照30min，使分布在磷脂片层中的单体发生光交联，形成磷脂膜内部的聚合物支架。
S7：在纳米孔一侧的缓冲液中加入2μL的α-HL溶液，随后在磷脂膜两侧施加+40mV的偏置电位将蛋白嵌入交联后的磷脂膜中，得到具有蛋白通道的新型交联磷脂双层膜。
实施例2
实施例2与实施例1相比，区别在于：DPhPC：EHMA：TEGDMA：DEAP的摩尔比为1：0.5：0.5：0.5。
实施例3
实施例3与实施例1相比，区别在于：DPhPC：EHMA：TEGDMA：DEAP的摩尔比为1：2：2：2。
实施例4
实施例4与实施例1相比，区别在于：利用紫外灯进行辐照交联的时间为20min。
实施例5
实施例5与实施例1相比，区别在于：利用紫外灯进行辐照交联的时间为40min。
实施例6
实施例6与实施例1相比，区别在于：选取短杆菌肽A作为跨膜蛋白嵌入磷脂膜中。
实施例7
实施例7与实施例1相比，区别在于：在进行紫外辐照交联之前，先在纳米孔一侧的缓冲液中加入2μL的α-HL溶液，并在磷脂膜两侧施加+40mV的偏置电位将蛋白嵌入未交联的磷脂膜中，随后利用紫外灯进行辐照交联30min。
在不同条件下制备具有蛋白通道的磷脂膜，并测定其击穿电压和磷脂膜寿命，其结果见表1。表1中，DPhPC为二植酰磷脂酰胆碱；TEGDMA为三乙二醇二甲基丙烯酸酯；EHMA为甲基丙烯酸丁酯。
表1不同条件下所制备的具有蛋白通道的磷脂膜的稳定性
由表1可知，统磷脂膜稳定性较差，寿命仅6小时左右，本申请所得磷脂膜稳定性大幅提高，寿命最高可增至45小时，击穿电压提高到2000mV。
虽然本发明的具体实施方式对本发明进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
