一种核壳结构金纳米粒子其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米凝胶
技术领域
，具体涉及一种核壳结构金纳米粒子其制备方法和应用。背景技术
公开该
背景技术
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。酶(enzyme)是活细胞产生的一种有机物，其组成成分为大量的蛋白质以及少数的遗传物质RNA，这也使得其对底物具有高度特异识别功能和催化效能。酶属生物大分子，它的催化作用高度赖于分子的一级结构和空间结构的完整，若酶分子变性或者解聚均可致使其丧失活性。
随着人们对酶分子的结构与功能、酶促反应动力学等的深入研究，天然酶的一些严重缺点也逐步显现出来，如催化活性不稳定，依赖结构的完整性，反应过程容易受环境影响以及天然酶的制备、纯化和储存十分繁琐和昂贵等。人工模拟酶应运而生，并成为了新的研究热点。到目前为止，已经发现超过40种类型的纳米材料具有固有的酶样活性，包括Fe3O4、Co3O4、CeO2、BiFeO3、MnFe2O4、CdS等的过氧化物酶活性；Au、Pt、CoFe2O4、ZnFe2O4等的氧化酶活性；MnO2、五氧化二钒纳米粒的卤化过氧化物酶活性；纳米铂、富勒烯衍生物和纳米氧化铈的超氧化物歧化酶活性。其中，基于贵金属的纳米酶-金纳米酶以其制备过程简单、尺寸可调节、稳定性强、易进行表面修饰等优点，引起了研究者的极大兴趣。
发明人研究发现金颗粒虽然具有一定的活性，但依然存在不可避免的缺陷，特殊尺寸在展现优点的同时也导致裸露金纳米颗粒在生理盐水以及特殊pH环境中极易迅速聚集而失去其特性。为了防止这一现象的发生，通常会向纳米金的溶液中加入某些稳定剂(表面活性剂)，但这也引入了一些其他物质，会对模拟酶的催化作用造成或多或少地影响。
发明内容
为了解决现有技术中金颗粒作为酶进行使用时出现的稳定性差，在生理盐水以及特殊pH环境中极易迅速聚集而失去其特性，催化性能有限的问题，本发明提出一种核壳结构金纳米粒子，该材料不仅具备金纳米粒子的生物模拟酶活性，对于葡萄糖、H2O2具有了选择性；还能够防止其聚集，实现了在溶液中较好的分散。另外，本发明还提供该核壳结构金纳米粒子的制备方法，该方法简便易行，原料易得，应用于生产将具有良好的前景。
具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：
本发明第一方面，提供一种核壳结构金纳米粒子，包括以3-丁烯基胺盐酸改性的金纳米粒子内核，以及包覆在所述金纳米粒子内核表面的凝胶壳层，所述的凝胶壳层为丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺的共聚物。
本发明第二方面，提供一种核壳结构金纳米粒子的制备方法，包括：3-丁烯基胺盐酸改性的金纳米粒子与丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、交联剂、引发剂发生聚合反应，即得。
本发明第三方面，提供一种核壳结构金纳米粒子在检测过氧化氢和/或葡萄糖领域中的应用。
本发明第四方面，提供一种过氧化氢检测试剂或检测器，包括核壳结构金纳米粒子。
本发明第五方面，提供一种葡萄糖检测试剂或检测器，包括核壳结构金纳米粒子。
本发明一个或多个技术方案具有以下有益效果：
1)本发明中核壳结构金纳米粒子包括以3-丁烯基胺盐酸改性的金纳米粒子内核，以及包覆在所述金纳米粒子内核表面的凝胶壳层，所述的凝胶壳层为丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺的共聚物。通过3-丁烯基胺盐酸改性金纳米粒子，3-丁烯基胺盐酸上的胺基通过静电作用吸附在金纳米粒子表面，间接的具备乙烯基的功能性，可以直接对乙烯基聚合和封装，产生凝胶壳层。
2)本发明在制备过程中通过使用十二烷基硫酸钠，提高裸露的纳米金颗粒的稳定性。
3)本发明首次发现核壳结构金纳米粒子对过氧化物酶底物四甲基联苯胺(TMB)具有催化氧化能力，在H2O2共存的情况下，金核纳米凝胶能加速TMB的氧化反应生成的蓝色产物氧化TMB(Ox-TMB)。
4)葡萄糖可以被葡萄糖氧化酶分解为过氧化氢和葡萄糖酸，且过氧化氢的量一般多于葡萄糖酸。在葡萄糖检测过程中，依旧借助H2O2与TMB的显色反应。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1核壳结构金纳米粒子的制备示意图；
图2为实施例1核壳结构金纳米粒子的透射电子显微镜图；
图3是实施例2中TMB显色剂存在时H2O2检测的紫外吸收谱图及显色图；
图4是实施例3中TMB显色剂存在时葡萄糖检测的紫外吸收谱图及显色图；
图5是对比例1制备的裸露金和实施例1制备的[email protected]在25mmol/LH2O2溶液中催化效能对比；
图6为对比例1制备的AuNPs、对比例2制备的AuNPs-BA和实施例1制备的[email protected]的紫外吸收图谱；
图7为对比例1制备的AuNPs和实施例1制备的[email protected]在盐分环境中的紫外吸收。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了解决现有技术中金颗粒作为酶进行使用时出现的稳定性差，在生理盐水以及特殊pH环境中极易迅速聚集而失去其特性，催化性能有限的问题，本发明提出一种核壳结构金纳米粒子，该材料不仅具备金纳米粒子的生物模拟酶活性，对于葡萄糖、H2O2具有了选择性；还能够防止其聚集，实现了在溶液中较好的分散。另外，本发明还提供该核壳结构金纳米粒子的制备方法，该方法简便易行，原料易得，应用于生产将具有良好的前景。
具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：
本发明第一方面，提供一种核壳结构金纳米粒子，包括以3-丁烯基胺盐酸改性的金纳米粒子内核，以及包覆在所述金纳米粒子内核表面的凝胶壳层，所述的凝胶壳层为丙烯酰胺(AAM)和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)的共聚物。
在本发明中，通过3-丁烯基胺盐酸改性金纳米粒子，3-丁烯基胺盐酸上的胺基通过静电作用吸附在金纳米粒子表面，间接的具备乙烯基的功能性，可以直接对乙烯基聚合和封装，产生凝胶壳层。
在本发明一个或多个实施方式中，所述金纳米粒子的尺寸为3-30nm。金纳米粒子的尺寸过大，比表面积小，不利于表面改性以及后期包覆层的形成，同时尺寸过大影响过氧化氢的检测灵敏度和复合材料的稳定性。如果金纳米粒子的尺寸过小，则容易产生粘连和团聚。
优选地，所述凝胶壳层层为网状水凝胶结构，其厚度为1-10nm。网状水凝胶结构来自于丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺与金纳米粒子表面改性的乙烯基的共聚物。
本发明第二方面，提供一种核壳结构金纳米粒子的制备方法，包括：3-丁烯基胺盐酸改性的金纳米粒子与丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、交联剂、引发剂发生聚合反应，即得。
丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺在交联剂和引发剂的作用下，与乙烯基发生聚合反应，在金纳米粒子表面形成网状壳层。
3-丁烯基胺盐酸改性是通过铵基与金纳米粒子的物理吸附，使金纳米粒子表面具有C＝C，如果没有C＝C则无法在金纳米粒子表面发生共聚。另外如果未使用3-丁烯基胺盐酸改性金纳米粒子，直接将金纳米粒子与丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺发生聚合反应，则两种单体也只是在溶液中聚合，无法直接在金表面产生凝胶壳层。
为了直接在纳米表面发生聚合反应产生凝胶壳层，在制备过程中逐滴加入3-丁烯基胺盐酸(BA)。在本发明一个或多个实施方式中，3-丁烯基胺盐酸改性的金纳米粒子的制备方法包括：将金纳米粒子水溶液与3-丁烯基胺盐酸乙醇溶液进行搅拌、离心，收集沉淀。3-丁烯基胺盐酸上的胺基通过静电作用吸附在纳米金表面，间接的具备乙烯基的功能性，可以直接对乙烯基聚合和封装。
3-丁烯基胺盐酸乙醇溶液中3-丁烯基胺盐酸浓度直接影响金纳米粒子表面改性情况，3-丁烯基胺盐酸浓度过高或过低，与金纳米粒子接触不良，或者发生团聚，或者无法均匀改性。因此在一些实施方式中，所述3-丁烯基胺盐酸乙醇溶液中3-丁烯基胺盐酸浓度为2.0-3.0mmol/L，优选为2.88mmol/L。
优选地，所述金纳米粒子水溶液浓度为10mmol/L。金纳米粒子水溶液与3-丁烯基胺盐酸乙醇溶液反应时，为保证金纳米粒子完全被改性，3-丁烯基胺盐酸过量，未反应的3-丁烯基胺盐酸经离心去除。
优选地，所述搅拌速率为800-1200rpm，优选为1000rpm，搅拌时间为10-30min，优选为20min。3-丁烯基胺盐酸通过胺基与金纳米粒子连接，如果搅拌速率过快，物理吸附可能被破坏，导致3-丁烯基胺盐酸在金纳米粒子表面的负载量变少，影响与单体的聚合反应。如果搅拌速率过慢，改性剂和金纳米粒子容易产生聚集或沉淀，负载不均匀。
优选地，所述离心参数为6000rpm，30min。
离心过程是在水中完成的，目的是除去未反应的单体，除去上清液后，聚沉的产物重新分散在水中并进行保存。
在本发明一个或多个实施方式中，所述制备方法包括：先将丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、交联剂分散在水中，排除装置内空气，加热搅拌，然后加入3-丁烯基胺盐酸改性的金纳米粒子搅拌，接着加入引发剂进行反应。
不同于传统的将金纳米粒子、单体、交联剂、引发剂同时进行反应的方案，本发明一些实施方式，先将单体、交联剂进行混合，使其均匀分散，为下一步聚合反应做准备。排除空气的目的是利用惰性气体(如氮气、氩气或者氦气)排除反应体系中的氧，以避免阻聚作用。将核材料、单体、交联剂混合均匀后，最后加入引发剂，可以保证在金纳米粒子表面均匀形成包覆层。
单体浓度、原料比例直接影响包覆效果，在一些实施方式中，所述丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、交联剂的质量比为：5-8:50-60:8-15，优选为7:56:10，所述丙烯酰胺浓度为0.5g/L。
在一些实施方式中，加热温度为60-80℃，加热搅拌时间为0.5-2h，优选为70℃，1h，加热目的是更好的在金纳米粒子表面进行聚合反应，形成均匀的包覆层。
在一些实施方式中，加入3-丁烯基胺盐酸改性的金纳米粒子后搅拌10-30min，优选为15min。
为了进一步提高原料分散均匀性，在体系中均匀发生聚合反应，在本发明一个或多个实施方式中，所述引发剂先溶于水制备成15-20g/L的溶液，加入反应体系中，引发剂溶液浓度优选为17g/L。
优选地，引发剂溶液与3-丁烯基胺盐酸改性的金纳米粒子、丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、交联剂混合溶液体积比为1:14；
为了保证交联、聚合反应，加入引发剂后搅拌反应1.5-2.5h，优选为2h，反应时间过长，过度聚合，包覆层完全掩盖金纳米粒子特性，检测灵敏度降低。
优选地，所述交联剂选自N，N'-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)，引发剂选自过硫酸铵(APS)、过硫酸或者2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮；
优选地，所述制备方法反应结束后还包括冷却、离心、纯化步骤。
金纳米粒子为现有技术，只要能制得符合尺寸要求的金纳米粒子的保护方法均可。在本发明一个或多个实施方式中，所述金纳米粒子制备方法包括采用柠檬酸钠还原氯金酸；
优选地，将氯金酸水溶液搅拌，加热至沸腾，然后加入已预热好的柠檬酸钠水溶液，在沸腾状态下持续搅拌20-30min后冷却至室温，分离即得；
进一步稳定裸露的纳米金颗粒，加入3-丁烯基胺盐酸前在室温下在反应过程中加入表面活性剂，优选为阴离子表面活性剂；
优选地，所述阴离子表面活性剂选自十二烷基硫酸钠。
优选地，所述氯金酸水溶液浓度为5×10-4mol/L，柠檬酸钠水溶液浓度为1wt％，氯金酸水溶液、柠檬酸钠水溶液、阴离子表面活性剂体积比为50:2.433:0.291。
更进一步优选地，将50mL 5×10-4mol氯金酸水溶液装入装有三口瓶中，搅拌并加热至沸腾，然后加入2.433mL(1wt％)提前预热的柠檬酸钠水溶液，在沸腾状态下持续搅拌20min后溶液冷却至室温(25℃)。为了稳定纳米金，将0.291mL0.1mmol/L的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液加入其中，搅拌20min后，加入0.953mL 2.88mmol 3-丁烯基胺盐酸(BA)乙醇溶液，继续搅拌20min。所得金纳米粒子水分散溶液在6000rpm 30min离心后获取沉淀物，分散在20mL水中，超声分散，最后保存至冰箱中待用。
本发明第三方面，提供一种核壳结构金纳米粒子在检测过氧化氢和/或葡萄糖领域中的应用。
本发明第四方面，提供一种过氧化氢检测试剂或检测器，包括核壳结构金纳米粒子。
本发明第五方面，提供一种葡萄糖检测试剂或检测器，包括核壳结构金纳米粒子。
本发明第六方面，提供一种过氧化氢检测方法，包括将核壳结构金纳米粒子加入到醋酸-醋酸盐缓冲液中，然后加入四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液，再加入过氧化氢溶液，混合液孵育，最后，在分光光度计上收集紫外-可见吸收光谱。
本发明第七方面，提供一种葡萄糖检测方法，包括将核壳结构金纳米粒子和葡萄糖溶液加入到PBS缓冲液中，并在37℃温水浴中持续、避光孵育，接下来将混合液离心取得上清液，然后在HAc-NaAc缓冲液中通过基于HRP(5μg/mL，20μL)-TMB(10mM，100μL)的显色反应验证上清液(100μL)中生成的H2O2。最后，在分光光度计上收集紫外-可见吸收光谱。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
1、表面修饰双键的金纳米粒子的制备
将装有50mL 5×10-4mol氯金酸水溶液的三口瓶(100mL)并置于电加热套中，磁力搅拌并加热至沸腾，然后快速加入2.433mL(1wt％)提前预热的柠檬酸钠水溶液，在沸腾状态下持续搅拌20min后溶液冷却至室温。为了稳定纳米金，将0.291mL 0.1mmol/L的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液加入其中，搅拌20min后，逐滴加入0.953mL 2.88mmol/L 3-丁烯基胺盐酸(BA)乙醇溶液，继续搅拌20min。所得金纳米粒子水分散溶液在6000rpm 30min离心后获取沉淀物，分散在20mL水中，超声分散，最后保存至冰箱中待用。
2、核壳结构金纳米粒子凝胶的制备
如图1所示，制备方法步骤如下：
将单体NIPAM(0.056g)、AAM(0.007g)、交联剂Bis(0.01g)置于三口瓶中加14mL超纯水溶解，放在油浴锅中磁力搅拌、加热至70℃。在三口瓶上加设回流冷凝器并持续通入氮气。一小时后，滴加10mL第一步获得的功能化金颗粒(沉淀物水溶液)并保温、搅拌15min，快速加入1mL 0.017g/mL引发剂APS的水溶液使其开始聚合。两小时后，使分散体冷却至室温，反应停止。将获得的核壳杂化颗粒离心，离心参数为6000rpm 60min，离心一次，核壳结构纳米粒子聚沉，未反应的单体以及溶液中的杂质处于上清液中，倒去上清液，取沉淀物再重新加入20mL超纯水即为重新分散。
将制得的适量核壳结构金纳米粒子凝胶溶液滴加在铜网上，至于恒温培养箱中12h。图2为实施例1制得的核壳结构金纳米粒子凝胶的透射电子显微镜图，由图可知，核壳结构金纳米粒子凝胶呈明显的核壳结构，包覆较为均匀，没有未包覆和团聚现象。
实施例2
纳米凝胶对过氧化氢的灵敏性检测
将0.1mL的实施例1制备的分散纳米凝胶溶液(理论浓度为25mmol/L)加入到醋酸-醋酸盐(Hac-NaAc 1.5mL 0.1mol/L，pH 4.0)缓冲液中，然后加入0.1mL四甲基联苯胺(TMB10mmol/L)乙醇溶液，再加入0.3mL过氧化氢(H2O2 10mmol/L)溶液，混合液孵育10min。最后，在UV-2500分光光度计上收集紫外-可见吸收光谱。
如图3所示，在H2O2的环境情况下，发现[email protected]金核纳米凝胶能加速TMB的氧化反应生成的蓝色产物(图3插图中右侧比色皿表现为深灰色)氧化TMB(Ox-TMB)，氧化TMB的最大紫外吸收峰表现在655+nm。相反，[email protected]与TMB体系(图3点-虚线)未在652nm处产生明显吸收带，其中轻微的吸收峰可能源自TMB的自氧化并非来自[email protected]纳米凝胶作用效果。并且当[email protected]与H2O2共存时并没有明显吸收，这些结果表明[email protected]金核纳米凝胶可作为过氧化氢模拟酶并且[email protected]的存在大大加速了反应的进行。
实施例3
纳米凝胶对葡萄糖的灵敏性检测
首先，将0.1mL的纳米凝胶和0.5mL葡萄糖(100m mol)溶液加入到PBS(1.4mL0.1mol/L，pH 9.0)缓冲液中，并在37℃温水浴中持续、避光孵育30min，接下来将混合液离心(10000rpm 10min)取得上清液，然后在HAc-NaAc缓冲液(0.1mol/L 500μL，pH 4.0)中通过基于辣根过氧化酶HRP(5μg/mL，20μL)-TMB(10mmol/L，100μL)的显色反应验证上清液(100μL)中生成的H2O2。最后，在UV-2500分光光度计上收集紫外-可见吸收光谱。
如图4所示，在葡萄糖与[email protected]纳米凝胶孵育后获取的上清液中加入HRP-TMB显色剂体系呈现出较好的紫外特征吸收(氧化TMB的紫外吸收)，然而仅使用葡萄糖或葡萄糖加入TMB显色剂的对照组实验没有出现明显的紫外特征吸收峰，这表明[email protected]具有同天然葡萄糖氧化酶相似的效果且[email protected]催化的葡萄糖氧化反应中确实产生了H2O2。
对比例1纳米金颗粒(AuNPs)的制备
将装有50mL 5×10-4mol氯金酸水溶液的三口瓶(100mL)并置于电加热套中，磁力搅拌并加热至沸腾，然后快速加入2.433mL(1wt％)提前预热的柠檬酸钠水溶液，在沸腾状态下持续搅拌20min后溶液冷却至室温。
如图5所示，对比例1制备的裸露金和实施例1制备的[email protected]在25mmol/L H2O2溶液中，取0.1mL对比例1制备的AuNPs与0.1mL实施例1制备的[email protected]纳米凝胶两者催化效能对比，测试条件同实施例2，由图可知聚合物包裹前后包裹前后对AuNPs影响较小，在同浓度下裸露的AuNPs均略微强于[email protected]纳米凝胶，这可以理解为裸露的AuNPs更易于接触H2O2造成的。
对比例2表面修饰双键的金纳米粒子(AuNPs-BA)的制备
将装有50mL 5×10-4mol氯金酸水溶液的三口瓶(100mL)并置于电加热套中，磁力搅拌并加热至沸腾，然后快速加入2.433mL(1wt％)提前预热的柠檬酸钠水溶液，在沸腾状态下持续搅拌20min后溶液冷却至室温。为了稳定纳米金，将0.291mL 0.1mmol/L的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液加入其中，搅拌20min后，逐滴加入0.953mL 2.88mmol/L 3-丁烯基胺盐酸(BA)乙醇溶液，继续搅拌20min。所得金纳米粒子水分散溶液在6000rpm 30min离心后获取沉淀物，分散在20mL水中，超声分散，最后保存至冰箱中待用。
图6为对比例1制备的AuNPs、对比例2制备的AuNPs-BA和实施例1制备的[email protected]的紫外吸收图谱，分别取0.1mL的实施例1制备的分散纳米凝胶溶液(理论浓度为25mmol/L)和BA修饰的AuNPs-BA溶液(理论浓度为25mmol/L)以及相同浓度裸露金纳米粒子(AuNPs)溶液分别溶解到1.9mL的超纯水中，最后，在UV-2500分光光度计上收集紫外-可见吸收光谱。
由于裸露的球形金纳米颗粒的表面等离子体共振，其最大吸收带约为523nm。3-丁烯胺盐酸盐中的氨基通过静电作用吸附在裸露的球形金纳米颗粒的表面并在表面创建可继续功能化的双键，图6显示通过这种功能化改进金纳米颗粒AuNPs-BA的最大紫外吸收产生轻微红移约为526nm。另外，由于金核的存在，用紫外-可见光谱很容易对合成的[email protected]纳米凝胶进行表征。对比凝胶壳合成前后金纳米粒子的紫外吸收光谱，[email protected]纳米凝胶的最大红外吸收出现在约528nm处。由于聚合物壳层使金纳米粒子周围的环境变化，等离子体激元带出现了轻微的红移。此外，聚合物壳层合成后没有金胶体聚集的迹象。这些等离子体吸收带都反映了存在一个被聚合物外壳包裹的孤立的金纳米颗粒核心，而不是被困在聚合物凝胶中的多个金颗粒，或者简单的物理掺杂。
图7为对比例1制备的AuNPs和实施例1制备的[email protected]在盐分环境中的紫外吸收。在1.9mL水中和1.9mL浓度为0.2M NaCl溶液中分别加入0.1mL的实施例1制备的分散纳米凝胶溶液(理论浓度为25mmol/L)和相同浓度裸露金纳米颗粒，静置10min，在UV-2500分光光度计上收集紫外-可见吸收光谱。
柠檬酸盐稳定的金纳米粒子在加入NaCl后容易聚集，导致纳米粒子吸收带红移，而蛋白质或聚合物保护的金纳米粒子则能抵抗盐诱导的聚集。图7显示在浓度大至0.2MNaCl溶液中裸露金纳米颗粒迅速聚集其最大紫外吸收也随之出现较大的红移失去其本身特有属性。在同样浓度下的[email protected]金核纳米凝胶出现抵抗盐聚集的行为，在大浓度NaCl溶液中仍在523nm左右出表现出最大紫外吸收，这表明形成的聚合物凝胶壳层保护了裸露的金纳米颗粒。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
