一种基于激活jwa基因和降解her2的抗肿瘤化合物、其制备方法及其用途
本发明是申请日为2019年8月12日，申请号为201910739357.4，发明名称为“一种基于激活JWA基因和降解HER2的抗肿瘤化合物、其制备方法及其用途”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤化合物，该化合物基于激活JWA基因和降解HER2发挥抗肿瘤作用，同时还涉及该化合物的制备方法及用途，属于抗肿瘤药物领域。
背景技术
恶性肿瘤(癌症)是严重威胁中国人群健康的重大公共卫生问题。国家癌症中心2019年发布的统计数据显示，恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％，且近十几年来恶性肿瘤的发病死亡均呈持续上升态势，每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过2200亿，防控形势严峻。与历史数据相比，癌症负担呈持续上升态势。近10多年来，恶性肿瘤发病率每年保持约3.9％的增幅，死亡率每年保持2.5％的增幅。肺癌、肝癌、上消化系统肿瘤及结直肠癌、女性乳腺癌等依然是我国主要的恶性肿瘤。肺癌位居男性发病第1位，而乳腺癌为女性发病首位。从年龄分布看，恶性肿瘤的发病随年龄的增加而上升，40岁以下青年人群中恶性肿瘤发病率处于较低水平，从40岁以后开始快速升高，发病人数分布主要集中在60岁以上，到80岁年龄组达到高峰；不同恶性肿瘤的年龄分布均有差异。在过去的10余年里，恶性肿瘤生存率呈现逐渐上升趋势，目前我国恶性肿瘤的5年相对生存率约为40.5％，与10年前相比提高约10个百分点，但是与发达国家还有很大差距。恶性肿瘤发病存在性别差异，男性发病首位为肺癌，每年新发病例约52.0万，其他高发恶性肿瘤依次为胃癌、肝癌、结直肠癌和食管癌等，前10位恶性肿瘤发病约占男性全部恶性肿瘤发病的82.20％。女性发病首位为乳腺癌，每年发病约为30.4万，其他主要高发恶性肿瘤依次为肺癌、结直肠癌、甲状腺癌和胃癌等，女性前10位恶性肿瘤发病约占女性全部恶性肿瘤发病的79.10％。
自1985年鉴定人表皮生长因子受体2(ERBB2或HER2)以来，人类ERBB2(HER2)癌基因在肿瘤学，尤其是乳腺癌(BC)中的相关性一直广受关注。该基因编码185-kD跨膜人表皮生长因子受体2(HER2)，属于HER1(或EGFR)、HER3和HER4等受体家族的成员。它们的酪氨酸激酶域的激活通常是通过一个特定的配体诱导的同二聚和异二聚来实现的。一旦激活，通过家族受体的细胞信号传导就会导致细胞的增殖和存活。HER2的激活机制与其它分子有别，它缺乏特定的生长因子配体，而是由于其固定的构象而被激活，这类似于配体激活的条件。这一特性使得HER2成为该家族其它受体的首选异二聚伴侣分子。
HER2阳性乳腺癌(HER2+BC)占所有BCs的15-20％。在过去20年中，针对HER2的单克隆抗体(MoAbs)、酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)和抗体-药物偶联物(adc)的发明和使用显著改善了患者的预后。然而，只有大约50％的HER2阳性患者对靶向治疗有反应，对于HER2+转移性BC(mBC)几乎无效。大多数治疗失败的原因是对抗-HER2治疗的原发性或获得性耐药性。近年来，多种耐药机制已被发现，如与HER2结合的药物受损、与HER2平行或下游信号通路的本构性激活、代谢重编程或免疫系统活性降低等。因此，对于HER2阳性的患者来说，寻找如何降解过表达HER2蛋白的治疗方法成为当前的迫切需求。
本专利发明人周建伟带领研究团队在过去20多年里一直聚焦探索他自己发现和命名的JWA(又名ARL6IP5)基因的结构和功能，特别是该基因与人类重大疾病之间的关系，且已取得系列研究成果。先后发现JWA基因是参与细胞分化调节的关键分子(Chinese SciBull,2001；ChineseSci Bull,2002；BiochemBiophys Res Commu,2006)；JWA蛋白是细胞骨架结合蛋白，有调节细胞骨架组装和细胞迁移的功能(Chinese Sci Bull,2003；ChineseSci Bull.2004；Cell Signal.2007)；JWA是机体组织正常细胞活跃的环境应答基因和DNA修复蛋白(J Biomed Sci,2005；FreeRadic Biol Med,2007；Nucleic Acids Res,2009)；JWA基因表达水平在胃癌、黑色素瘤、食管癌、肝癌等多种癌组织中表达水平显著低于其癌旁正常组织；癌组织JWA表达水平与患者生存期呈正相关(Oncogene,2010；Clin CancerRes,2012；J Gastroenterol,2013；Carcinogenesis,2013；Carcinogenesis,2014)；在对顺铂耐药的研究中还发现，提高顺铂耐药胃癌细胞JWA表达水平，可通过抑制CK2活性进而抑制DNA修复蛋白XRCC1的磷酸化水平和胃癌细胞对顺铂的耐受性，使得此类癌细胞对顺铂的敏感性得到恢复(Cell Death Dis,2014)。近年还发现，在胃癌细胞中JWA可通过转录和翻译后泛素化修饰机制抑制HER2表达水平，而这一机制与JWA抑制胃癌细胞的恶性表型有关(Oncotarget,2016a,2016b)。综上所述，JWA基因可通过多种不同的分子机制作用于多靶点发挥抑癌基因的作用。
同时，基于这一系列研究成果，本专利发明人已经申请了多项发明专利，包括：专利号CN98111422.9、授权公告号CN1065876C、名称《细胞骨架样基因的编码蛋白特异性抗体》的发明专利；专利号CN201310178099.X、授权公告号CN103239710B、名称为《具有抗肿瘤活性的多肽及其用途》的发明专利；专利号CN201610164491.2、授权公告号CN105820230B、名称为《一种抗肿瘤活性多肽及其用途》的发明专利；专利号CN201610857409.4、授权公告号CN106632299B、名称为《抗肿瘤化合物、其制备方法及其用途》的发明专利。
发明内容
本发明的主要目的是：基于现有技术，根据发明人的最新研究成果，提供一种基于激活JWA基因和降解HER2的抗肿瘤化合物，能够激活JWA基因表达后通过级联激活E3泛素化酶等机制特异性降解HER2，从而实现对HER2过表达恶性肿瘤的抑制或治疗作用。同时，提供该化合物的制备方法和用途。
本发明的主要技术构思如下：发明人依据前期系列研究成果中显示的JWA具有突出的抑癌基因生物学功能，并在多种人类恶性肿瘤的发生发展实验性干预模型中得到验证。由于多数恶性肿瘤组织细胞中JWA蛋白表达水平显著低于其癌旁正常组织，而JWA蛋白又具有抑制HER2过表达的作用。因此，发明人设计构建了含有JWA基因启动子调节区的报告基因细胞模型，并经高通量筛选以发现能激活JWA基因表达的小分子化合物；如果获得预期的小分子化合物，则在HER2高表达的癌细胞中予以验证其潜在的抗肿瘤生物学效应。
发明人课题组以此为主要技术构思，经与国家化合物库等机构合作开展高通量筛选，并以筛选后获得的一些先导化合物为基础，进一步进行针对性的化合物分子结构修饰，合成了一系列双苯并噻唑胺类化合物；再用多种细胞模型和动物模型研究验证，发现该系列化合物确能有效激活细胞和小鼠体内组织器官JWA基因表达。
本发明提供的抗肿瘤化合物如下：
一种基于激活JWA基因和降解HER2的抗肿瘤化合物，为式I化合物：
其中，R1选自OH、CH3、CH2CH3、OCH3、OCH2CH3；
R2选自H、OH、CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3、OCH3、OCH2CH2CH3；
R3选自F、Cl、Br、I、CF3；
R4选自H、F、Cl、Br、I、CF3；
R5选自H、CH3、CH2CH3。
此类化合物为双苯并噻唑胺类化合物。
优选地，R1为OCH3；R2为H或OCH3；R3为F或CF3；R4为H或F；R5为H。
优选地，所述式I化合物为以下化合物之一：
4-氟-N-(4-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺；4,7-二氟-N-(4-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺；4,6-二氟-N-(4-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺；4-甲氧基-N-(4-(三氟甲基)苯并[d]噻唑-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺；N-(4-氟苯并[d]噻唑-2-基)-4,7-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-胺；N-(4-氟苯并[d]噻唑-2-基)-4,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-胺；4,7-二甲氧基-N-(4-(三氟甲基)苯并[d]噻唑-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺；4,6-二甲氧基-N-(4-(三氟甲基)苯并[d]噻唑-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺；
其结构式分别为：
经实验验证，上述抗肿瘤化合物确能有效激活细胞和小鼠体内组织器官JWA基因表达。特别有意义的是，发明人课题组的研究揭示了上述抗肿瘤化合物通过级联激活E3泛素化酶等机制特异性降解肿瘤细胞中过表达的HER2蛋白，并具有抑制肿瘤细胞增殖、生长等功能。与此同时，还在过表达HER2的人乳腺癌细胞皮下荷瘤裸鼠模型中验证了上述抗肿瘤化合物中的代表化合物的显著抑瘤效应；特别地，该代表化合物还在发挥显著抑瘤效应的同时显示出对小鼠心脏、肝脏和肾脏等主要脏器功能有一定保护作用(详细内容见下文的具体实施例)。
本发明还提供：
前文所述抗肿瘤化合物的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
其中，X为Cl、Br、I之一；所述铜盐为氧化铜、氧化亚铜、氯化铜、氯化亚铜、溴化铜、溴化亚铜或碘化亚铜；所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、叔丁醇钾或氢化钠；所述溶剂为四氢呋喃、二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺；所述加热温度为80～120℃。(注：R1、R2、R3、R4和R5的限定如前文所述，此处不再赘述)
优选地，X为Cl；所述铜盐为碘化亚铜；所述碱为碳酸钾；所述溶剂为二甲基亚砜；所述加热温度为100℃。
本发明还提供：
前文所述抗肿瘤化合物的药用盐。
优选地，所述药用盐为式I化合物与盐酸、硫酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、磷酸、氢溴酸、马来酸、富马酸或苹果酸形成的盐。
本发明还提供：
含有前文所述抗肿瘤化合物、或者前文所述药用盐的药物组合物。
本发明还提供：
前文所述抗肿瘤化合物、或者前文所述药用盐、或者前文所述药物组合物用于制备JWA基因激活剂或抗肿瘤药物的用途。
优选地，所述肿瘤为JWA基因低表达且HER2过表达的相关肿瘤，所述肿瘤包括乳腺癌、胃癌、肺癌、脑胶质瘤等；所述抗肿瘤药物是通过激活JWA蛋白的表达后降解HER2蛋白来实现抗肿瘤作用的药物。
此外，至于上文的抗肿瘤化合物、药用盐、药物组合物的具体剂型，可根据现有技术视实际需要进行选择，如片剂、散剂、丸剂、胶囊剂、栓剂、颗粒剂、混悬剂、口服液、注射剂等药学上的剂型；其中，口服用药片和胶囊含有传统的赋形剂如：填充物、润滑剂、分散剂、稀释剂以及粘合剂。
与现有技术相比，本发明的抗肿瘤化合物及其药用盐能够有效激活JWA蛋白的表达，并进一步通过级联激活E3泛素化酶等特异性降解过表达的HER2蛋白从而抑制肿瘤细胞的增殖和体内生长。
本发明抗肿瘤化合物及其药用盐的突出优势是可以降解癌细胞中过表达的HER2蛋白，这与迄今为止国际上通用的各种抗-HER2抗体或抑制HER2蛋白激酶活性的抑制剂完全不同。从分子细胞生物学理论可知，采用本发明抗肿瘤化合物及其药用盐能显著优于目前针对HER2过表达癌症的抗癌治疗手段，原因是本发明抗肿瘤化合物的作用是最终降解HER2蛋白，这可从根本上消除目前使用抗-HER2抗体或抑制剂后因HER蛋白适应性变构导致的耐药现象的物质基础。本发明抗肿瘤化合物及其药用盐在较低剂量下同样具有显著的治疗肿瘤的活性，并且对正常组织细胞不仅无毒性，还对心、肝、肾等重要脏器有一定保护作用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例11中JWA基因cDNA、编码蛋白氨基酸和用于构建报告基因的启动子序列图。
图2为本发明实施例11中含JWA基因启动子的报告基因结构图。
图3为本发明实施例12中JAC1对两种人乳腺癌细胞克隆形成的影响结果图。
图4为本发明实施例13中JAC1对两种人乳腺癌细胞HER2表达和细胞定位的影响结果图。
图5为本发明实施例14中JAC1激活两种人乳腺癌细胞JWA表达同时抑制HER2表达的结果图。
图6为本发明实施例15中JAC1抑制BT474和SKBR3两种人乳腺癌细胞迁移的结果图。
图7为本发明实施例16中JAC1处理人乳腺癌BT474细胞皮下荷瘤小鼠体重增长曲线图。
图8为本发明实施例16中JAC1处理人乳腺癌BT474细胞皮下荷瘤体积曲线图。
图9为本发明实施例16中JAC1处理人乳腺癌BT474细胞小鼠皮下荷瘤重量的结果图。
图10为本发明实施例16中JAC1处理人乳腺癌细胞小鼠皮下荷瘤的瘤重/体重比结果图。
图11为本发明实施例16中各处理组分离的人乳腺癌BT474皮下荷瘤瘤组织结果图。
图12为本发明实施例16中各组人乳腺癌BT474细胞小鼠皮下荷瘤的抑瘤率结果图。
图13为本发明实施例16中各组人乳腺癌BT474细胞小鼠皮下荷瘤组织的相关分子表达图。
图14为本发明实施例17中JAC1处理人乳腺癌细胞皮下荷瘤小鼠主要脏器HE染色照片。
图15为本发明实施例18中JAC1处理人乳腺癌细胞皮下荷瘤小鼠血液生化结果图。
图16为本发明实施例19中JAC1激活JWA表达并抑制HER2表达的脱靶效应验证结果图。
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例1
4-氟-N-(4-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺的制备：
在配有球形回流冷凝管、磁子的50mL干燥茄形瓶中，加入2-氯-4-氟苯并[d]噻唑(1g,5.3mmol)，4-甲氧基苯并[d]噻唑-2-胺(0.96g,5.3mmol)，碘化亚铜(0.31g,0.3mmol)，碳酸钾(1.47g,10.6mmol)，二甲基亚砜(20ml)，加热至100℃，反应6小时。反应结束后，冷却至室温，加水(60ml)，乙酸乙酯(30mL)，萃取3次，水洗，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂，得黑色固体，粗产物硅胶粉制沙，硅胶色谱柱纯化[洗脱剂:VPE:VEA＝5:1]，得到黑色固体，用乙酸乙酯或甲醇打数次浆后，得白色固体化合物(0.7g，产率：39％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.75(d,J＝5.8Hz,1H),7.49(d,J＝7.9Hz,1H),7.28-7.17(m,3H),7.00(d,J＝8.0Hz,1H),3.92(s,3H)。
ESI-MS m/z:332.1{[M+H]+}。
实施例2
4,7-二氟-N-(4-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺的制备：
参照实施例1所示方法，其中“2-氯-4-氟苯并[d]噻唑”替换为“2-氯-4,7-二氟苯并[d]噻唑”，得到灰白色固体(1.1g，产率：57％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.73(d,J＝5.4Hz,1H),7.28-7.17(m,3H),7.02(d,J＝8.0Hz,1H),3.92(s,3H)。
ESI-MS m/z:350.1{[M+H]+}。
实施例3
4,6-二氟-N-(4-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺的制备：
参照实施例1所示方法，其中“2-氯-4-氟苯并[d]噻唑”替换为“2-氯-4,6-二氟苯并[d]噻唑”，得到灰白色固体(0.8g，产率：45％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.65(d,J＝5.8Hz,1H),7.35(d,J＝7.9Hz,1H),7.28-7.17(m,2H),7.03(d,J＝8.0Hz,1H),3.92(s,3H)。
ESI-MS m/z:350.1{[M+H]+}。
实施例4
4-甲氧基-N-(4-(三氟甲基)苯并[d]噻唑-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺的制备：
参照实施例1所示方法，其中“2-氯-4-氟苯并[d]噻唑”替换为“2-氯-4-(三氟甲基)苯并[d]噻唑”，得到白色固体(1.1g，产率：67％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.55(d,J＝5.8Hz,1H),7.39(d,J＝7.9Hz,1H),7.15-7.07(m,3H),7.00(d,J＝8.0Hz,1H),3.92(s,3H)。
ESI-MS m/z:382.1{[M+H]+}。
实施例5
N-(4-氟苯并[d]噻唑-2-基)-4,7-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-胺的制备：
参照实施例1所示方法，其中“4-甲氧基苯并[d]噻唑-2-胺”替换为“4,7-甲氧基苯并[d]噻唑-2-胺”，得到白色固体(1.4g，产率：73％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.74(d,J＝5.8Hz,1H),7.36(d,J＝7.9Hz,1H),7.27-7.15(m,1H),7.00(d,J＝8.0Hz,2H),3.82(s,3H),3.76(s,3H)。
ESI-MS m/z:362.1{[M+H]+}。
实施例6
N-(4-氟苯并[d]噻唑-2-基)-4,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-胺的制备：
参照实施例1所示方法，其中“4-甲氧基苯并[d]噻唑-2-胺”替换为“4,6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-胺”，得到白色固体(1.2g，产率：64％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.75(d,J＝5.8Hz,1H),7.28-7.17(m,2H),7.21(s,1H),6.79(s,1H),3.88(s,3H),3.83(s,3H)。
ESI-MS m/z:332.1{[M+H]+}。
实施例7
4,7-二甲氧基-N-(4-(三氟甲基)苯并[d]噻唑-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺的制备：
参照实施例1所示方法，其中“2-氯-4-氟苯并[d]噻唑”替换为“2-氯-4-(三氟甲基)苯并[d]噻唑”，“4-甲氧基苯并[d]噻唑-2-胺”替换为“4,7-甲氧基苯并[d]噻唑-2-胺”，得到白色固体(0.9g，产率：53％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.75(d,J＝5.8Hz,1H),7.49(d,J＝7.9Hz,1H),7.28-7.17(m,1H),7.00(d,J＝8.0Hz,2H),3.92(s,3H)。
ESI-MS m/z:412.1{[M+H]+}。
实施例8
4,6-二甲氧基-N-(4-(三氟甲基)苯并[d]噻唑-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺的制备：
参照实施例1所示方法，其中“2-氯-4-氟苯并[d]噻唑”替换为“2-氯-4-(三氟甲基)苯并[d]噻唑”，“4-甲氧基苯并[d]噻唑-2-胺”替换为“4,6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-胺”，得到白色固体(0.8g，产率：47％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.75(d,J＝5.8Hz,1H),7.49(d,J＝7.9Hz,1H),7.28-7.17(m,1H),7.21(s,1H),7.69(s,1H),3.92(s,3H)。
ESI-MS m/z:412.1{[M+H]+}。
需要说明的是，实施例1至实施例8仅举出了本发明高通量筛选出的部分化合物，并非本发明的全部化合物。
实施例9
药用组合物的制备：片剂
将式I化合物或其药用盐(1g)与乳糖(23g)和微晶纤维素(5.7g)用混合机混合。用滚轴压紧机将所得混合物压制成型，值得薄片状压制物料。用锤式粉碎机将所述薄片状压制物料研磨成粉，使所得粉状物料通过20目筛过筛。将一份轻质二氧化硅(0.3g)和硬脂酸镁(0.3g)加入到已过筛的物料中，并混合。所得混合产物用制片机压片，制备片剂。
作为示例，式I化合物可采用实施例1至实施例8的化合物。
作为示例，药用盐的酸根部分可采用盐酸、硫酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、磷酸、氢溴酸、马来酸、富马酸或苹果酸。
实施例10
药用组合物的制备：明胶胶囊剂
将式I化合物或其药用盐(1g)与微晶纤维素(0.35g)和乳糖(0.15g)用水制粒，然后将该颗粒与铰链羧甲基纤维素钠(0.04g)和硬脂酸镁(0.01g)混合。所得混合产物填充明胶胶囊，制备明胶胶囊剂。(本实施例的明胶胶囊由中国苏州胶囊有限公司生产，该明胶胶囊符合药用标准)
作为示例，式I化合物可采用实施例1至实施例8的化合物。
作为示例，药用盐的酸根部分可采用盐酸、硫酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、磷酸、氢溴酸、马来酸、富马酸或苹果酸。
实施例11
双苯并噻唑胺类化合物生物学活性的比较：
将实施例1至实施例8合成的化合物依次命名为JAC1，JAC1011，JAC1012，JAC1013，JAC1014，JAC1015，JAC1016，JAC1017。
采用稳定转染含有JWA基因2000bp启动子序列和荧光素酶指示功能的报告基因的人支气管上皮HBE细胞进行高通量筛选，经过两轮高通量筛选，化合物浓度范围是0.00～3.30μg/mL，化合物处理细胞时间是48小时，测得以上8个代表性化合物的报告基因荧光值如表1；8个代表性化合物的中英文对照关系见表2。
由表1结果可知，这8个化合物均能激活细胞JWA基因表达而且呈良好的剂量-效应关系，其中，JAC1对JWA基因的激活作用尤为显著。
JWA基因全长cDNA序列、编码蛋白氨基酸序列和用于构建荧光素酶报告基因的JWA基因2000bp启动子DNA序列见图1。含JWA基因启动子序列的荧光素酶报告基因分子结构见图2。
表1.双苯并噻唑胺类化合物及其报告基因筛选荧光值
表2.双苯并噻唑胺类化合物编号及其中英文名称
实施例12
JAC1对HER2阳性乳腺癌细胞克隆形成(恶性增殖)能力的影响：
本实施例目的在于检测小分子化合物JAC1处理对HER2过表达的人乳腺癌细胞BT474和SKBR3的克隆形成(恶性增殖)能力的影响。
两种人乳腺癌细胞株BT474和SKBR3培养于DMEM培养基中，分别含有20％和10％胎牛血清，常规双抗，37℃含5％CO2。取对数生长期的BT474和SKBR3细胞，分别以800个/孔的密度均匀种于六孔板，待细胞贴壁后更换为含有不同浓度(0、1、10μM)的含JAC1培养基分别处理细胞。根据细胞克隆团生长情况，培养10-15天后终止细胞培养，去除培养皿，用甲醇固定后结晶紫染色生长的细胞克隆团，拍照后用ImageJ软件计数克隆团(含50个细胞以上)的数目，统计软件SPSS分析计数结果。
实验结果如图3所示，与对照组相比,不同剂量的小分子化合物JAC1处理BT474和SKBR3后，显著抑制细胞克隆形成能力，且呈剂量效应关系。
需要说明的是，对于实施例1至实施例8的其余各化合物，按本实施例方法进行检测后，其结果与JAC1基本一致，均能显著抑制BT474和SKBR3的细胞克隆形成能力，且呈剂量效应关系。
实施例13
JAC1对HER2阳性乳腺癌细胞HER2分子在细胞定位的影响：
本实施例目的在于观察小分子化合物JAC1处理后对HER2在细胞中定位是否有影响。
将细胞接种于35mm的激光共聚焦专用皿中，用不同浓度(0、1、10μM)的JAC1处理细胞24小时后，甲醇固定15分钟，PBST洗涤三次，用正常羊血请封闭1小时，然后加入一抗4℃孵育过夜，次日用PBST洗涤三次后加入荧光二抗以及DAPI后，于激光共聚焦下拍摄。
实验结果如图4所示，随着JAC1浓度的升高，JWA含量升高，HER2表达水平下降，但减弱的HER2依然定位在细胞膜，即JAC1处理对HER2的细胞膜定位特性并无影响。
需要说明的是，对于实施例1至实施例8的其余各化合物，按本实施例方法进行检测后，其结果与JAC1基本一致，即随化合物浓度的升高，JWA含量升高，HER2表达水平下降，但减弱的HER2依然定位在细胞膜，即其处理对HER2的细胞膜定位特性并无影响。
实施例14
JAC1对HER2阳性乳腺癌细胞JWA和HER2蛋白表达水平的影响：
本实施例的目的是用细胞模型验证JAC1处理后对升高JWA和降低HER2蛋白表达水平的作用。
常规消化处于对数生长期的细胞，铺于6孔板，细胞密度为40％-50％，用不同剂量JAC1处理细胞24小时后，加入0.1mL RIPA(含0.5％PMSF)细胞裂解液收取蛋白，12000×g离心15分钟后取上清，测蛋白浓度，煮蛋白。选用10％浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白电泳，每孔加入40μg蛋白，电泳条件选用60V，30分钟，90V，1.5-2小时。电泳完毕后湿转法转膜，使得蛋白从凝胶内转移至PVDF膜上。转膜完毕后，5％脱脂牛奶常温下封闭1-2小时，TBST(含0.1％Tween 20)洗膜3次，每次5分钟，4℃孵育相应一抗过夜。次日，TBST(含0.1％Tween20)洗膜3次，每次5分钟，室温孵育二抗1-2小时，TBST(含0.1％Tween20)洗膜8次，每次5分钟。膜上滴加ECL发光液，曝光。
实验结果如图5所示，随着JAC1浓度的增加，JWA蛋白水平升高，而HER2蛋白水平下降。
需要说明的是，对于实施例1至实施例8的其余各化合物，按本实施例方法进行检测后，其结果与JAC1基本一致，即随化合物浓度的升高，JWA蛋白水平升高，而HER2蛋白水平下降。
实施例15
JAC1对HER2阳性乳腺癌细胞迁移能力的影响：
本实施例的目的是通过Transwell迁移实验，检测JAC1对乳腺癌细胞BT474和SKBR3细胞迁移能力的影响。
取对数生长期的BT474和SKBR3细胞，铺于6孔板，细胞密度为40％-50％，待细胞贴壁后加药，JAC1浓度分别0、1和10μM。Transwell小室铺胶：实验前一天，准备24孔板，若干个Transwell小室。将FN稀释，母液1mg/mL，稀释10倍到终浓度100μg/mL。每个小室的底部涂FN50μL，在超净台中放置2小时风干，细胞培养箱中过夜。
实验当天，用0.25％的胰酶消化细胞，悬浮到无血清的培养基中，细胞计数，调整细胞密度为3×105个/ml，种100μL到Transwell小室的上层。小室的下室加入600μL含有10％FBS以及100ng/ml EGF培养基。培养箱中培养12小时后，将Transwell小室取出，用95％甲醇固定20分钟。用PBS洗3遍，用结晶紫染色30分钟。再用PBS洗3遍，用棉签轻轻擦去上室的细胞。最后将小室放在载玻片上，在倒置显微镜下观察并拍照，每个小室上、下、左、右、中各拍一个视野，计数穿过上层小室的细胞数并统计分析。
实验结果如图6所示，JAC1能够显著抑制乳腺癌细胞BT474和SKBR3的迁移能力，且呈剂量-效应关系。
需要说明的是，对于实施例1至实施例8的其余各化合物，按本实施例方法进行检测后，其结果与JAC1基本一致，能够显著抑制乳腺癌细胞BT474和SKBR3的迁移能力，且呈剂量-效应关系。
实施例16
JAC1对HER2阳性乳腺癌细胞皮下荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响：
本实施例的目的是建立人乳腺癌细胞免疫缺陷小鼠皮下荷瘤模型，用JAC1干预后观察其对乳腺癌细胞皮下生长的影响。
取对数生长期的人源性乳腺癌细胞BT474细胞，在无菌条件下制备成5×106/100μL细胞悬液，并对BALB/c裸鼠进行皮下荷瘤，待瘤体积大小在75-125mm3时，对小鼠进行随机分组，分为空白对照组(Mock)、溶剂对照组(vehicle)、50mg/kg JAC1处理组、100mg/kgJAC1组以及阳性对照赫赛汀联合紫杉醇(TH)处理组。其中JAC1：每日给药，腹腔注射；赫赛汀：10mg/kg，每周两次给药，腹腔注射；紫杉醇：20mg/kg，每周一次给药，腹腔注射。从给药之日起，每隔两天称量小鼠体重，同时观察并测量小鼠瘤径，计算瘤体积。按照动物伦理学要求，待本次模型小鼠中荷瘤肿瘤体积达到2500-3000mm3，结束模型，麻醉后安乐死处理实验动物，进行相应检测分析。
结果发现：实验期间各组小鼠体重均呈现缓慢上升趋势(图7)。
与对照组相比，50mg/kg JAC1处理组、100mg/kg JAC1组及赫赛汀联合紫杉醇(TH)处理组的肿瘤体积增长速度明显降低(图8)，瘤重减小(P<0.05)，各组平均瘤重大小依次是TH组<100mg/kg JAC1组<50mg/kg JAC1组(图9)；瘤重体重比降低(P<0.05)，且TH组瘤重体重比值最低(图10)。
图11为各组小鼠分离的肿瘤组织图。
肿瘤抑制率：50mg/kg JAC1处理组为31.22％、100mg/kg JAC1组为46.21％，赫赛汀联合紫杉醇(TH)处理组为52.36％；50mg/kg JAC1、100mg/kg JAC1、赫赛汀联合紫杉醇均有效，各处理组抑瘤率大小依次是：TH>100mg/kg JAC1>50mg/kg JAC1(图12)。
进一步对个处理组乳腺癌皮下荷瘤的肿瘤组织相关分子表达水平进行免疫印迹检测，结果见图13，JAC1处理组HER2表达显著下降而JWA表达水平显著增加；TH组在本实验条件下无法检出HER2表达，因为赫赛汀是人源化抗-HER2抗体，该抗体使用后已与细胞HER2蛋白表位结合，使得免疫印迹实验中一抗无法再与HER2结合。
实施例17
JAC1处理对荷瘤小鼠主要脏器结构的影响：
按实施例16建立JAC1抑制人乳腺癌细胞皮下荷瘤生长裸鼠模型。模型结束时，为观察各处理条件下对实验小鼠主要脏器有无损伤，麻醉和安乐死处理小鼠后，取小鼠主要脏器组织心、肝、脾、肺、肾、脑用福尔马林溶液常规固定，石蜡包埋后常规切片，用HE染色首先检测小鼠主要脏器形态结构是否正常。结果显示，本次实验条件下，各处理组小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)光镜下未见明显异常(图14)。
实施例18
JAC1处理对荷瘤小鼠血液生物化学指标的影响：
按实施例16建立JAC1抑制人乳腺癌细胞皮下荷瘤生长裸鼠模型。模型结束时，为观察各处理条件下对实验小鼠主要脏器有无损伤，麻醉小鼠后取全血分离血清，用全自动生化分析仪检测血清生化指标变化。如图15所示，结果显示，尽管各处理组小鼠主要脏器在形态结构上未见明显病变，然而，与对照组相比，JAC1处理，特别是100mg/kg JAC1处理组小鼠血清中肝功能ALT和AST、甘油三酯TG、心肌激酶CK及其同工酶CKMB均显著降低，抗氧化作用的超氧化歧化酶SOD的水平则显著增加。这些指标在紫杉醇+赫赛汀处理组也比对照组有所改善但差异均无统计学意义。
这些结果提示，JAC1不仅可以有效抑制人乳腺癌BT474细胞小鼠皮下荷瘤的生长，还对肿瘤生长导致的体内生化功能紊乱有较好的干预作用；阳性对照药处理组尽管抑瘤率略高于JAC1处理组，但其对肿瘤引起的体内生化功能紊乱的改善作用并不显著。
实施例19
JAC1激活JWA表达同时抑制HER2表达的脱靶效应验证：
在观察到JAC1小分子以上特异性作用于HER2过表达癌细胞的这些生物学功能之后，我们对JAC1抑瘤作用的脱靶效应进行了实验验证。首先用Crisp/cas9技术构建了HER2阳性的剔除JWA基因人BGC823胃癌细胞，分别用含有JWA(JWA WT)和缺失JWA(JWA KO)基因的人胃癌细胞BGC823株(以往已经证明其为HER2表达阳性)，用JAC1 10μM处理细胞48小时后收取蛋白，用免疫印迹法检测JWA野生和缺失性BGC823细胞JWA和HER2表达水平。
如图16所示，结果显示：在JWA野生型(JWA WT)胃癌细胞，JAC1处理可显著激活JWA表达同时抑制HER2表达水平；然而在JWA缺失(JWA KO)的胃癌细胞，JAC1处理后对JWA和HER2表达未见显著影响。
这些结果说明JAC1对HER2的抑制作用是通过激活JWA实现的，JAC1没有明显的脱靶效应。
实施例20
本发明按实施例11方法进行高通量筛选时获得了很多能激活细胞JWA基因表达的化合物，除实施例1至实施例8的化合物外，其余化合物如下所示：
R1＝OH，R2＝H或OH，R3＝F或Cl，R4＝H或F，R5＝H或CH3或CH2CH3；
R1＝CH3，R2＝CH3或CH2CH3，R3＝I或CF3，R4＝Br或CF3，R5＝H或CH3或CH2CH3；
R1＝CH2CH3，R2＝CH2CH2CH3或OCH3，R3＝Br或Cl，R4＝Cl或I，R5＝H或CH3或CH2CH3；
R1＝OCH3，R2＝OCH2CH2CH3或OH，R3＝F或CF3，R4＝H或CF3，R5＝H或CH3或CH2CH3；
R1＝OCH2CH3；R2＝CH3或OCH3，R3＝Cl或I，R4＝Br或I，R5＝H或CH3或CH2CH3。
注：当上述化合物的取代基可存在于多个取代位置、或化合物存在多个同分异构体时，则表示包括所有可能的化合物。
上述化合物均能激活细胞JWA基因表达，从而也具备制成JWA基因激活剂或抗肿瘤药物的前景，因此，这些化合物均应当包含入本发明的保护范围。
此外，本发明化合物还可与其他药物和其他治疗手段联合使用，以增强治疗恶性肿瘤的效果。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
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