5-羟甲基-2-巯基甲基-1-甲基-1h-吲哚-3-羧酸乙酯衍生物及制备与应用
技术领域
本发明涉及一种衍生物及其制备方法，具体涉及5-羟甲基-2-巯基甲基-1-甲基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯衍生物的制备及其在抗流感药物领域的应用，属于有机合成与医药应用
技术领域
。背景技术
流行性感冒是由流感病毒引发的急性呼吸道传染病，春、秋季高发，具有传染性强、流行面广、潜伏期短并能够引起多种并发症等特点，每年都会造成20-50万人死亡，对儿童、老人等高危人群有较大威胁。近年来，流感病毒不断变异，人畜共患病的威胁不断增加，使得目前的抗流感形势日益严峻，给社会造成了极大恐慌。M2离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂等的广泛应用给流感的治疗带来了希望，但耐药病毒株的出现严重降低了现有药物的疗效。因此，开发新型、安全、高效和抗耐药性的流感病毒抑制剂已成为非常紧迫的科研任务。
流感病毒的生命周期包括吸附、内吞、融合、复制、翻译、装配、出芽和释放。血凝素(Hemagglutinin，HA)是一个约220kDa的糖蛋白同源三聚体，广泛存在于流感病毒包膜上。目前已发现18种HA，根据氨基酸序列不同分为两个组：Group-1和Group-2。Group-1包括H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18；Group-2包括H3、H4、H7、H10、H14和H15。HA在病毒生命周期中的作用包含以下两点:(1)可以在病毒和宿主细胞表面之间提供连接，促进病毒附着在宿主细胞；(2)促使病毒膜和宿主细胞内膜发生融合，释放病毒内部遗传物质。成熟的流感HA单体由两个亚基(HA1和HA2)通过二硫键连接组成，HA1和HA2以不同的方式发挥作用。HA1区为高抗原区，HA2区为保守性的膜融合区，有助于核小体内的病毒与细胞膜融合。鉴于HA介导流感病毒进入宿主是病毒感染的第一步，在病毒整个生命周期中发挥了重要作用，近年来以HA为靶点进行抗流感药物研发成为热点。
发明内容
本发明提供了5-羟甲基-2-巯基甲基-1-甲基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯衍生物及其制备方法，本发明还提供了上述化合物的部分活性筛选结果及其制药用途。
本发明的技术方案如下：
一、5-羟甲基-2-巯基甲基-1-甲基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯衍生物
本发明的5-羟甲基-2-巯基甲基-1-甲基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯衍生物，具有如下通式A-n所示的结构：
其中，
R为C2-C6烷基羧酸、各种取代的苯环或者各种取代的的六元杂环；所述的取代基选自C1-C6羧基、C1-C6酚羟基、卤素、三氟甲基、硼酸或氰基。
根据本发明优选的，R为乙酸基、丙酸基、具有通式(a)的苯环或具有通式(b)的吡啶环；
其中，R1、R2、R3、R4和R5各自独立为H、CN、OH、CH2OH、CF3、COOH、CH2COOH、CH2CH2COOH、B(OH)2、F、Cl、Br；R6为COOH。
进一步优选的，5-羟甲基-2-巯基甲基-1-甲基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯衍生物，是下列之一：
二、5-羟甲基-2-巯基甲基-1-甲基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯衍生物的制备方法
本发明4-苯基磺酰基-1-三羟基苯甲酰基哌嗪-2-羧酰胺衍生物的制备方法，以4-氨基-3-碘苯甲酸甲酯为起始原料，首先与乙酰乙酸乙酯环合生成吲哚环，然后用碘甲烷在1-位氮原子上进行甲基化，用N-溴代丁二酰亚胺对2-位甲基进行溴化，之后与各种巯基或硫酚取代基发生亲核取代并经二异丁基氢化铝还原生成A-n；
化合物A-n的合成路线如下：
反应试剂与反应条件：i)乙酰乙酸乙酯，碘化亚铜，1,1'-联-2-萘酚，碳酸铯，二甲基亚砜，氮气保护，50℃；ii)碘化钾，氢化钠，N,N-二甲基甲酰胺，室温；iii)N-溴代丁二酰亚胺，过氧化苯甲酰，乙酸乙酯；iv)取代巯基或硫酚，氢化钠，四氢呋喃，室温；v)二异丁基氢化铝，四氢呋喃，0℃。
其中，R如上述通式A-n中所述。
本发明5-羟甲基-2-巯基甲基-1-甲基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯衍生物的制备方法，以目标化合物A-n为例，具体步骤如下：
(1)将4-氨基-3-碘苯甲酸甲酯，乙酰乙酸乙酯，碘化亚铜，1,1'-联-2-萘酚和碳酸铯用10mL无水二甲基亚砜溶解，氮气保护下50℃反应7小时；加入30mL乙酸乙酯，用饱和氯化铵溶液30ml洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥，蒸去溶剂，用乙酸乙酯/正己烷的体系进行硅胶柱层析，得红棕色固体b-1；
(2)将b-1和60％氢化钠用12mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌30分钟，然后逐滴加入碘甲烷，反应10分钟；反应完毕后，加入50mL水，加入30mL乙酸乙酯萃取三次，有机层用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，得棕色固体c-1；
(3)将c-1溶于40mL乙酸乙酯，加热回流后加入N-溴代丁二酰亚胺和过氧化苯甲酰，反应15分钟；蒸除溶剂，用乙酸乙酯/正己烷的体系进行硅胶柱层析，得淡红色固体d-1；
(4)室温下，将化合物d-1用5mL无水四氢呋喃溶解，搅拌下依次加入氢化钠和相应的巯基或硫酚类化合物，反应3小时；蒸干溶剂，用乙酸乙酯/正己烷的体系加入1.3％的冰乙酸进行硅胶柱层析，得固体e-1；
(5)冰浴下，将化合物e-1用5mL无水四氢呋喃溶解，搅拌下加入1mL二异丁基氢化铝溶液，重复操作至原料反应完毕；加入1mL 10％稀硫酸溶液，室温搅拌6小时，然后加入30mL水，用30mL乙酸乙酯萃取三次，收集有机相，然后用无水硫酸镁干燥，蒸干，用含1.3％冰乙酸的乙酸乙酯/正己烷的体系进行硅胶柱层析，得化合物A-n。
所得目标化合物A-n结构见表1。
表1目标化合物的结构式
三、5-羟甲基-2-巯基甲基-1-甲基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯衍生物的应用
细胞水平的流感病毒抑制活性测试结果表明，5-羟甲基-2-巯基甲基-1-甲基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯衍生物是一系列结构新颖的流感病毒HA抑制剂，3个目标化合物对流感病毒PR8-PB2-Gluc(H1N1)或A/Hong Kong/1/1968(H3N2)表现出显著的抑制活性，其中，化合物A-1活性最优，抑制H3N2的EC50为9.86±0.67μM，与上市药物盐酸阿比多尔(EC50＝6.36±0.51μM)相当；化合物A-19细胞毒性(CC50＝316.3±157.74μM)显著低于盐酸阿比多尔(CC50＝198.53±39.43μM)，说明该类化合物具有进一步研究的价值。
因此，本发明所提供的5-羟甲基-2-巯基甲基-1-甲基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯衍生物可作为HA抑制剂用于制备抗流感药物。
一种抗流感的药物组合物，含有上述的5-羟甲基-2-巯基甲基-1-甲基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯衍生物及其药学上可接受的盐与药用辅料，制成不同剂型的药物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，所有目标化合物的编号与表1相同，所述百分比数均为质量百分比。
实施例1：中间体3-乙基5-甲基2-甲基-1H-吲哚-3,5-二羧酸(b-1)的制备
将4-氨基-3-碘苯甲酸甲酯(2g，7.22mmol)，乙酰乙酸乙酯(1.248g，9.590mmol)，碘化亚铜(0.248g,1.299mmol)，1,1'-联-2-萘酚(0.392g,1.618mmol)，碳酸铯(2.232g,6.850mmol)用10mL无水二甲基亚砜溶解，氮气保护下50℃反应7小时。加入30mL乙酸乙酯，用饱和氯化铵溶液30ml洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥，蒸去溶剂，用乙酸乙酯/正己烷的体系进行硅胶柱层析，得红棕色固体b-1，产率：52.2％，mp：195-197℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.17(s,1H),8.65(d,J＝1.7Hz,1H),7.77(dd,J＝8.5,1.8Hz,1H),7.45(d,J＝8.5Hz,1H),4.31(q,J＝7.1Hz,2H),3.86(s,3H),1.37(t,J＝7.1Hz,3H).ESI-MS:m/z 260.36[M-H]-,C14H15NO4(261.10).
实施例2：中间体3-乙基5-甲基1,2-二甲基-1H-吲哚-3,5-二羧酸(c-1)的制备
将b-1(0.1g，0.382mmol)，60％氢化钠(0.0296g，0.574mmol)用12mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌30分钟，然后逐滴加入碘甲烷(0.163g，1.148mmol)，反应10分钟。反应完毕后，加入50mL水，加入30mL乙酸乙酯萃取三次，有机层用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，得棕色固体c-1，产率：90％，mp：140-142℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.69(d,J＝1.7Hz,1H),7.83(dd,J＝8.5,1.7Hz,1H),7.64(d,J＝8.7Hz,1H),4.33(q,J＝7.1Hz,2H),3.87(s,3H),3.78(s,3H),2.75(s,3H),1.38(t,J＝7.1Hz,3H).ESI-MS:m/z 274.52[M-H]-,C15H17NO4(275.12).
实施例3：中间体3-乙基5-甲基2-(溴甲基)-1-甲基-1H-吲哚-3,5-二羧酸(d-1)的制备
将c-1(1.75g，6.360mmol)溶于40mL乙酸乙酯，加热回流后加入N-溴代丁二酰亚胺(1.70g，9.551mmol)，过氧化苯甲酰(0.11g，0.445mmol)，反应15分钟。蒸除溶剂，用乙酸乙酯/正己烷的体系进行硅胶柱层析，得淡红色固体d-1，产率：63.2％，mp：110-112℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.74(s,1H),7.92(d,J＝8.9Hz,1H),7.74(d,J＝8.8Hz,1H),5.32(s,2H),4.42–4.35(m,2H),3.89(s,3H),3.88(d,J＝2.1Hz,3H),1.44–1.37(m,3H).ESI-MS:m/z354.18[M+H]+,C15H16BrNO4(353.03).
实施例4：中间体3-乙基-5-甲基-2-(((3-羟基苯基)硫基)甲基)-1-甲基-1H-吲哚-3,5-二羧酸二甲酯(e-1)的制备
室温下，将化合物d-1(0.11g，0.282mmol)用5mL无水四氢呋喃溶解，搅拌下依次加入氢化钠(16.93mg，0.423mmol)和3-羟基苯硫酚(0.338mmol)，反应3小时。蒸干溶剂，用含1.3％冰乙酸的乙酸乙酯/正己烷的体系进行硅胶柱层析，得固体e-1，产率：63.4％，mp：140-142℃。ESI-MS:m/z 397.94[M-H]-,C21H21NO5S(399.12).
实施例5：终产物A-n的通用制法
冰浴下，将化合物e-1(0.3mmol)用5mL无水四氢呋喃溶解，搅拌下加入1mL二异丁基氢化铝溶液，重复操作至原料反应完毕。加入1mL 10％稀硫酸溶液，室温搅拌6小时，然后加入30mL水，用30mL乙酸乙酯萃取三次，收集有机相，然后用无水硫酸镁干燥，蒸干，用含1.3％冰乙酸的乙酸乙酯/正己烷的体系进行硅胶柱层析，得化合物A-n。
5-(羟甲基)-2-(((3-羟苯基)硫代)甲基)-1-甲基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯(A-1)。由中间体e-1还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率70.1％，暗红色粉末，熔点130-132℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.55(s,1H),7.96(s,1H),7.49(d,J＝8.4Hz,1H),7.22(dd,J＝8.5,1.6Hz,1H),7.10(t,J＝7.8Hz,1H),6.82–6.73(m,2H),6.66(dd,J＝8.1,2.4Hz,1H),5.13(t,J＝5.9Hz,1H),4.83(s,2H),4.58(d,J＝4.8Hz,2H),4.25(q,J＝7.1Hz,2H),3.74(s,3H),1.32(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ164.93,158.13,143.30,136.45,136.31,135.90,130.28,125.96,122.56,121.59,119.60,117.72,114.72,110.40,104.27,64.09,59.59,30.49,28.58,14.80.ESI-MS:m/z 394.24[M+Na]+,C20H21NO4S(371.12).
5-(羟甲基)-2-(((2-羟基苯基)硫基)甲基)-1-甲基-1H-吲哚-3-羧酸甲酯(A-2)。由中间体e-2还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率53.2％，暗红色粉末，熔点185-187℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.72(s,1H),7.92(s,1H),7.46(d,J＝8.5Hz,1H),7.20(dd,J＝8.5,1.6Hz,1H),7.11-7.06(m,2H),6.64(dd,J＝9.4,2.9Hz,2H),4.64(s,2H),4.57(s,1H),4.16(q,J＝7.1Hz,2H),3.64(s,2H),1.28(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ199.29,164.83,158.48,144.11,136.31,136.23,136.00,126.00,122.41,121.81,119.56,116.38,110.29,104.17,64.09,59.40,30.64,30.36,14.81.ESI-MS:m/z 394.30[M+Na]+,C20H21NO4S(371.12).
5-(羟甲基)-2-(((4-羟基苯基)硫基)甲基)-1-甲基-1H-吲哚-3-羧酸甲酯(A-3)。由中间体e-3还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率22.1％，白色粉末，熔点188-189℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.93(s,1H),7.47(d,J＝8.3Hz,1H),7.20(dd,J＝8.5,1.6Hz,1H),7.14–7.05(m,2H),6.69–6.60(m,2H),4.64(s,2H),4.58(dd,J＝9.0,5.7Hz,2H),4.16(q,J＝7.1Hz,2H),3.65(s,3H),1.29(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ164.83,158.33,144.06,136.28,136.25,136.05,126.53,126.01,122.82,122.40,121.96,119.58,119.48,116.37,116.33,110.68,110.28,104.22,64.14,64.05,59.41,54.08,30.79,30.60,30.34,14.86,14.81.ESI-MS:m/z 394.27[M+Na]+,C20H21NO4S(371.12).
3-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)苯甲酸(A-4)。由中间体e-4还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率38.2％，白色粉末，熔点143-145℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.00–7.73(m,5H),7.50(d,J＝8.5Hz,1H),7.23(d,J＝8.6Hz,1H),4.99(s,2H),4.61–4.54(m,2H),4.24(q,J＝7.2Hz,2H),3.82(s,3H),1.31(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.85,164.97,142.24,138.33,136.56,136.40,133.97,130.46,129.96,125.75,122.73,122.43,119.63,110.47,104.82,64.04,59.73,30.70,28.01,14.77.ESI-MS:m/z 398.32[M-H]-,C21H21NO5S(399.11).
2-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)苯甲酸(A-5)。由中间体e-5还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率35.1％，棕色粉末，熔点151-153℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.99(s,1H),7.92(d,J＝7.8Hz,1H),7.61(d,J＝6.9Hz,2H),7.53(d,J＝8.5Hz,1H),7.32–7.23(m,2H),5.17(t,J＝5.9Hz,1H),4.88(s,2H),4.60(d,J＝5.6Hz,2H),4.33–4.23(m,2H),3.83(d,J＝1.7Hz,3H),1.30(td,J＝7.0,1.8Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ167.95,164.96,142.26,140.73,136.60,136.41,133.00,131.38,128.69,126.86,125.95,125.03,122.65,119.52,110.54,104.60,64.03,59.68,30.53,27.11,14.77.ESI-MS:m/z 398.27[M-H]-,C21H21NO5S(399.11).
5-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)间苯二甲酸(A-6)。由中间体e-6还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率8.8％，红色粉末，熔点>300℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.29(s,1H),8.06(s,2H),7.92(s,1H),7.58(dd,J＝6.9,3.1Hz,1H),7.50(d,J＝8.8Hz,1H),7.23(d,J＝8.5Hz,1H),4.99(s,2H),4.58(s,2H),4.24–4.14(m,2H),3.83(d,J＝1.8Hz,3H),1.31–1.22(m,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ167.17,164.87,142.76,136.47,136.36,135.52,135.42,132.19,131.90,129.63,128.46,125.86,122.63,119.60,110.42,104.58,64.07,59.60,30.59,28.53,14.75.ESI-MS:m/z 442.32[M-H]-,C22H21NO7S(443.10).
4-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)间苯二甲酸(A-7)。由中间体e-7还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率35.2％，白色粉末，熔点：230-233℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.06–7.98(m,2H),7.94(d,J＝8.0Hz,1H),7.76(d,J＝8.0Hz,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,1H),7.24(d,J＝8.5Hz,1H),4.89(s,2H),4.60(s,2H),4.27(q,J＝7.1Hz,2H),3.82(s,3H),1.29(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ164.95,142.47,136.55,136.43,129.74,127.10,126.01,122.59,119.54,110.49,104.47,64.05,59.65,30.57,27.29,14.75.ESI-MS:m/z 442.34[M-H]-,C22H21NO7S(443.1).
3-溴-5-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)苯甲酸(A-8)。由中间体e-8还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率54.3％，棕色粉末，熔点150-153℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(s,1H),7.85(d,J＝13.0Hz,2H),7.78(s,1H),7.49(d,J＝8.4Hz,1H),7.24(d,J＝8.4Hz,1H),4.98(s,2H),4.60(s,2H),4.25(q,J＝7.1Hz,2H),3.82(s,3H),1.32(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.88,164.98,142.22,138.30,136.47(d,J＝14.3Hz),133.97,130.48,129.98,125.76,122.74,122.42,119.66,110.43,104.84,64.07,59.74,30.67,28.03,14.76.ESI-MS:m/z 476.33[M-H]-,C21H20BrNO5S(477.02).
4-溴-3-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)苯甲酸(A-9)。由中间体e-9还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率43.2％，白色粉末，熔点140-142℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.97(d,J＝16.2Hz,2H),7.76(d,J＝8.4Hz,1H),7.67(d,J＝8.4Hz,1H),7.52(d,J＝8.5Hz,1H),7.24(d,J＝8.5Hz,1H),4.99(s,2H),4.58(s,2H),4.21(q,J＝6.9Hz,2H),3.85(d,J＝1.7Hz,3H),1.28(td,J＝7.1,1.9Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ166.81,164.83,141.51,137.32,136.55,136.48,134.17,133.56,131.66,131.01,128.96,128.86,125.86,122.74,119.58,110.51,104.88,64.04,59.68,30.65,27.93,14.73.ESI-MS:m/z 500.07[M+Na]+,C21H20BrNO5S(477.02).
2-溴-5-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)苯甲酸(A-10)。由中间体e-10还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率38.2％，白色粉末，熔点142-144℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.93(s,1H),7.71(t,J＝2.0Hz,1H),7.60(dd,J＝8.4,1.5Hz,1H),7.50(d,J＝8.3Hz,1H),7.33(dt,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.22(d,J＝8.5Hz,1H),4.92(s,2H),4.57(s,2H),4.26–4.17(m,2H),3.85–3.75(m,3H),1.29(td,J＝7.1,1.5Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ175.00,171.75,167.16,164.93,142.53,136.52,136.38,134.96,134.70,134.62,134.57,132.54,125.77,122.70,119.63,118.90,110.48,104.66,72.92,64.05,59.67,43.15,30.63,28.29,14.76.ESI-MS:m/z 476.31[M-H]-,C21H20BrNO5S(477.02).
2-氯-5-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)苯甲酸(A-11。由中间体e-11还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率35.1％，白色粉末，熔点155-157℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.93(d,J＝4.2Hz,1H),7.74(d,J＝2.0Hz,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,1H),7.42(d,J＝3.0Hz,2H),7.23(dt,J＝8.5,2.3Hz,1H),4.90(d,J＝14.7Hz,2H),4.57(s,2H),4.25–4.17(m,2H),3.79(d,J＝8.4Hz,3H),1.29(td,J＝7.1,1.9Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ166.57,164.91,142.56,136.52,136.39,134.80,134.21,133.01,132.72,131.42,130.83,130.79,130.64,129.69,125.80,122.69,119.64,119.61,110.45,104.67,64.07,60.51,59.65,30.62,28.76,28.50,14.78,14.75.ESI-MS:m/z 432.21[M-H]-,C21H20ClNO5S(433.08).
4-氯-3-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)苯甲酸(A-12)。由中间体e-12还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率68.2％，棕色粉末，熔点153-155℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.01(d,J＝2.1Hz,1H),7.94(s,1H),7.78(dd,J＝8.3,2.0Hz,1H),7.59(d,J＝8.3Hz,1H),7.51(d,J＝8.4Hz,1H),7.23(dd,J＝8.5,1.6Hz,1H),4.98(s,2H),4.58(s,2H),4.20(q,J＝7.1Hz,2H),3.84(s,3H),1.27(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ164.83,160.91,158.33,144.07,136.28,136.25,136.05,126.54,126.01,122.40,121.97,119.58,119.48,116.37,116.33,110.29,104.23,64.13,64.05,59.71,59.41,54.09,30.60,30.34,14.86,14.81.ESI-MS:m/z 432.36[M-H]-,C21H20ClNO5S(433.08).
3-氯-5-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)苯甲酸(A-13)。由中间体e-13还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率33.2％，白色粉末，熔点110-112℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.94(d,J＝1.6Hz,1H),7.79(t,J＝1.6Hz,1H),7.72(t,J＝1.7Hz,1H),7.68(t,J＝1.9Hz,1H),7.51(d,J＝8.5Hz,1H),7.23(dd,J＝8.5,1.6Hz,1H),5.00(s,2H),4.58(d,J＝3.4Hz,2H),4.24(q,J＝7.1Hz,2H),3.83(s,3H),1.31(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.95,164.97,142.22,138.18,136.57,136.42,134.16,133.83,133.65,129.58,127.57,125.76,122.73,119.62,110.46,104.83,64.05,59.71,30.68,28.02,14.75.ESI-MS:m/z 432.29[M+Na]+,C21H20ClNO5S(433.08).
3-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)-4-氟苯甲酸(A-14)。由中间体e-14还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率25.4％，白色粉末，熔点135-137℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96–7.86(m,3H),7.50(d,J＝8.4Hz,1H),7.30(t,J＝8.8Hz,1H),7.22(dd,J＝8.5,1.6Hz,1H),5.11(d,J＝5.7Hz,1H),4.88(s,2H),4.56(d,J＝5.6Hz,2H),4.13(q,J＝7.1Hz,2H),3.82(s,3H),1.25(t,J＝7.1Hz,3H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ166.61,164.81,141.64,138.26,136.54,136.48,135.00,131.91,131.01,130.27,129.21,125.88,122.74,119.59,110.48,104.87,64.06,59.65,30.62,27.64,14.72.ESI-MS:m/z 416.24[M-H]-,C21H20FNO5S(417.10).
3-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)-5-氟苯甲酸(A-15)。由中间体e-15还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率44.3％，白色粉末，熔点105-107℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.94(s,1H),7.71(d,J＝1.6Hz,1H),7.56–7.47(m,3H),7.23(dd,J＝8.5,1.6Hz,1H),5.13(s,1H),4.99(s,2H),4.57(s,2H),4.24(q,J＝7.1Hz,2H),3.82(s,3H),1.30(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ166.07,164.96,142.20,138.49(JCF＝8.0Hz),136.58,136.41,134.17(JCF＝7.7Hz),126.92(JCF＝2.5Hz),125.78,122.73,121.11(JCF＝23.4Hz),119.60,114.60(JCF＝22.9Hz),110.48,104.77,64.04,59.69,30.66,28.01,14.74.ESI-MS:m/z 416.44[M-H]-,C21H20FNO5S(417.10).
3-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)-2-氟苯甲酸(A-16)。由中间体e-16还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率34.1％，白色粉末，熔点150-152℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.84(s,1H),7.73(dd,J＝6.9,2.5Hz,1H),7.45–7.38(m,2H),7.18–7.11(m,2H),5.05(t,J＝5.8Hz,1H),4.78(s,2H),4.50(d,J＝5.0Hz,2H),4.10(q,J＝7.1Hz,2H),3.71(s,3H),1.20(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ164.83,164.76,164.73,142.79,138.94,138.84,136.43,136.36,136.08,129.93(JCF＝3.7Hz),125.80,122.63,120.41,119.61,118.12(JCF＝23.2Hz),110.39,104.66,64.08,59.55,30.55,29.32,14.73.ESI-MS:m/z 416.11[M-H]-,C21H20FNO5S(417.10).
5-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)-2-氟苯甲酸(A-17)。由中间体e-17还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率40.1％，红色粉末，熔点190-192℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.91(s,1H),7.77(t,J＝7.2Hz,1H),7.51(d,J＝8.6Hz,2H),7.23(d,J＝8.6Hz,1H),7.16(t,J＝7.7Hz,1H),5.13(s,1H),4.85(s,2H),4.62–4.50(m,2H),4.15(q,J＝7.2Hz,2H),3.81(s,3H),1.26(t,J＝7.4Hz,3H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.56,164.84,143.04,136.43,136.33,135.71(JCF＝2.6Hz),132.18,131.98,129.33,129.13,125.88,124.42,122.66,122.59,119.60,117.60(JCF＝23.8Hz),110.40,104.47,65.49,64.09,59.57,30.51,30.48,29.50,28.21,19.12,14.77,14.73,14.01.ESI-MS:m/z 416.22[M-H]-,C21H20FNO5S(417.10).
3-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)-4-(三氟甲基)苯甲酸(A-18)。由中间体e-18还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率35.1％，白色粉末，熔点122-124℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.06(s,1H),7.96(d,J＝8.4Hz,1H),7.91(s,1H),7.86(d,J＝8.3Hz,1H),7.51(d,J＝8.6Hz,1H),7.23(d,J＝8.5Hz,1H),5.02(s,2H),4.57(d,J＝5.3Hz,2H),4.15(q,J＝7.4Hz,2H),3.82(s,3H),1.25(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ166.08,164.78,141.70,136.51,136.44,135.23,134.88,128.70,125.73,122.76,119.57,110.43,104.90,63.98,59.59,30.56,29.20,14.67.ESI-MS:m/z 466.40[M-H]-,C22H20F3NO5S(467.10).
3-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)-5-(三氟甲基)苯甲酸(A-19)。由中间体e-19还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率42.1％，白色粉末，熔点121-123℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.10(s,1H),7.98(s,1H),7.93(s,1H),7.89(s,1H),7.51(d,J＝8.0Hz,1H),7.24(d,J＝8.5Hz,1H),5.05(s,2H),4.58(s,2H),4.21(q,J＝7.2Hz,2H),3.85(s,3H),1.28(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.85,164.96,142.14,137.90,136.57,136.43,134.80,133.04,130.90,130.67,130.35,125.69,124.20,122.75,119.62,110.46,104.91,64.02,59.63,30.73,30.47,27.93,14.66.ESI-MS:m/z466.28[M-H]-,C22H20F3NO5S(467.10).
3-氰基-5-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)苯甲酸(A-20)。由中间体e-20还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率64.2％，白色粉末，熔点185-187℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,J＝1.6Hz,1H),7.81(dd,J＝6.9,2.6Hz,1H),7.52–7.45(m,2H),7.26–7.17(m,2H),5.12(t,J＝5.8Hz,1H),4.85(s,2H),4.57(d,J＝5.3Hz,2H),4.17(q,J＝7.1Hz,2H),3.79(s,3H),1.28(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.69,164.99,142.04,137.86,136.82,136.61,136.43,135.15,134.19,131.22,125.71,122.77,119.61,117.99,112.91,110.50,104.86,64.03,59.73,30.69,27.95,14.75.ESI-MS:m/z 422.99[M-H]-,C22H20N2O5S(424.11).
3-(4-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)苯基)丙酸(A-21)。由中间体e-21还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率19.1％，白色粉末，熔点147-149℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.95(s,1H),7.48(d,J＝8.3Hz,1H),7.27(d,J＝7.7Hz,2H),7.22(d,J＝8.4Hz,1H),7.16(d,J＝7.9Hz,2H),4.80(s,2H),4.58(s,2H),4.20(q,J＝7.1Hz,2H),3.71(s,3H),2.79(t,J＝7.6Hz,2H),2.49(s,3H),1.29(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ174.11,164.89,143.49,140.90,136.42,136.30,132.05,131.90,129.39,125.94,122.55,119.60,110.39,104.26,64.09,59.55,35.53,30.45,30.33,29.14,14.80.ESI-MS:m/z 426.03[M-H]-,C23H25NO5S(427.15).
2-(3-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)苯基)乙酸(A-22)。由中间体e-22还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率32.1％，白色粉末，熔点：151-153℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.95(s,1H),7.49(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),7.32(dd,J＝8.1,2.1Hz,2H),7.25–7.17(m,3H),4.84(d,J＝2.0Hz,2H),4.58(d,J＝4.6Hz,2H),4.22(qd,J＝7.2,2.1Hz,2H),3.74(d,J＝2.0Hz,3H),3.55(d,J＝2.0Hz,2H),1.30(td,J＝7.1,2.0Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ172.95,164.91,143.35,136.45,136.31,134.81,132.86,132.51,132.01,131.91,131.49,130.51,129.29,129.17,125.92,122.57,119.61,110.42,104.30,64.08,59.58,30.49,28.91,14.81.ESI-MS:m/z 411.98[M-H]-,C22H23NO5S(413.13).
2-(4-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)苯基)乙酸(A-23)。由中间体e-23还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率53.6％，棕色粉末，熔点138-141℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.95(s,1H),7.49(d,J＝8.4Hz,1H),7.32(d,J＝7.7Hz,2H),7.23(t,J＝8.2Hz,3H),4.83(s,2H),4.58(s,2H),4.47(d,J＝4.3Hz,2H),4.22(q,J＝7.1Hz,3H),3.74(s,3H),1.34–1.28(m,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ164.92,143.45,142.42,136.42,136.30,132.51,131.64,127.40,125.91,122.55,119.60,110.40,104.33,64.07,62.81,59.56,30.51,29.00,14.81.ESI-MS:m/z 412.31[M-H]-,C22H23NO5S(413.13).
6-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫代)烟酸(A-24)。由中间体e-24还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率30.1％，白色粉末，熔点：170-172℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.00(s,1H),8.10(d,J＝8.4Hz,1H),7.98(s,1H),7.50(t,J＝9.5Hz,2H),7.24(d,J＝8.5Hz,1H),5.15(s,2H),4.59(s,2H),4.32(q,J＝7.1Hz,2H),3.85(s,3H),1.34(dd,J＝8.0,6.3Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ166.66,164.95,162.93,150.67,143.04,137.59,136.64,136.27,125.99,123.71,122.65,121.73,119.37,110.63,104.60,64.01,59.73,30.71,24.52,14.82.ESI-MS:m/z 399.23[M-H]-,C20H20N2O5S(400.11).
6-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)吡啶甲酸(A-25)。由中间体e-25还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率33.2％，黄色粉末，熔点：150-152℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.98(s,1H),7.84(d,J＝8.9Hz,2H),7.57(d,J＝7.5Hz,1H),7.50(d,J＝8.5Hz,1H),7.23(d,J＝8.5Hz,1H),5.16(s,2H),4.59(s,2H),4.32(q,J＝7.2Hz,2H),3.89(s,3H),1.35(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ166.29,165.00,158.09,148.97,144.15,138.45,136.63,136.22,126.06,125.46,122.58,121.71,119.36,110.70,104.31,64.03,59.70,30.80,24.05,14.82.ESI-MS:m/z399.14[M-H]-,C20H20N2O5S(400.11).
3-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫基)丙酸(A-26)。由中间体e-26还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率36.2％，黄色粉末，熔点：125-127℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.98(s,1H),7.51(d,J＝8.6Hz,1H),7.23(d,J＝8.5Hz,1H),5.13(t,J＝5.8Hz,1H),4.59(d,J＝5.5Hz,2H),4.47(s,2H),4.32(q,J＝7.1Hz,2H),3.80(d,J＝2.1Hz,3H),2.63(t,J＝7.1Hz,2H),2.47(d,J＝6.9Hz,2H),1.37(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ173.32,165.34,144.30,136.42,136.38,125.82,122.52,119.69,110.33,104.33,64.11,59.67,34.90,30.46,26.31,24.66,14.88.ESI-MS:m/z 350.21[M-H]-,C17H21NO5S(351.11).
2-(((3-(乙氧羰基)-5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲基)硫代)乙酸(A-27)。由中间体e-27还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率33.5％，白色粉末，熔点145-147℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.98(d,J＝1.5Hz,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,1H),7.22(dd,J＝8.5,1.6Hz,1H),4.59(s,2H),4.49(s,2H),4.31(q,J＝7.1Hz,2H),3.82(s,3H),1.37(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ171.43,165.12,143.71,136.40,136.37,125.91,122.50,119.62,110.36,104.34,64.08,59.62,33.94,30.42,25.55,14.86.ESI-MS:m/z336.23[M-H]-,C16H19NO5S(337.10).
5-(羟甲基)-2-(((3-(羟甲基)苯基)硫基)甲基)-1-甲基-1H-吲哚-3-羧酸甲酯(A-28)。由中间体e-28还原，经乙酸乙酯/正己烷的体系硅胶柱层析得到，收率37.3％，白色粉末，熔点110-112℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.03(s,1H),7.56(d,J＝8.5Hz,1H),7.30–7.23(m,2H),7.05(d,J＝2.5Hz,1H),6.97–6.90(m,2H),5.18(dt,J＝8.7,5.8Hz,2H),4.61(d,J＝5.8Hz,2H),4.48(d,J＝5.8Hz,2H),4.33(q,J＝7.1Hz,2H),3.86(s,3H),1.34(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.06,158.42,144.92,141.60,136.63,136.44,129.66,125.69,123.07,119.91,119.67,113.43,113.14,110.65,105.47,64.03,63.20,59.88,59.77,30.99,14.84.ESI-MS:m/z 386.07[M+H]+,C21H23NO4S(385.13).
实施例6：细胞水平流感病毒抑制活性测试实验
实验材料：
犬肾传代细胞(MDCK)；重组的报告病毒PR8-PB2-Gluc(H1N1)；流感病毒H3N2(A/Hong Kong/1/1968)；荧光素酶检测试剂盒(购于美国Thermo Fisher公司)
实验步骤：
(1)抑制PR8-PB2-Gluc(H1N1)效力测定。取96孔细胞板，每孔铺104个细胞，培养24小时后，用感染复数MOI＝0.01的重组流感病毒PR8-PB2-Gluc感染细胞。2小时后，用PBS洗去未吸附的病毒，然后加入浓度为10和1μM的化合物进行干预，同时设置不感染病毒、不加药的健康对照组和只感染病毒不加药的流感阴性对照组，在37℃的5％CO2孵育箱孵育36小时后，用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶的表达量，并计算不同药物浓度干预下的病毒复制抑制率和EC50值。
(2)抑制H3N2(A/Hong Kong/1/1968)效力测定。在96孔板上铺约25000个细胞，每孔加100μL Dulbecco's改良的Eagle培养基(含青霉素-链霉素，10％胎牛血清和非必需氨基酸)，然后在37℃的5％CO2孵育箱中孵育过夜。孵育完毕后用Dulbecco的PBS洗涤两次，随后加入100μL的OptiMEM稀释液(含0.8μg/mL的N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮处理过的胰蛋白酶和0.5％DMSO)。下一步，将细胞均分三份，在100TCID50病毒稀释液中连续稀释两次，然后在37℃的5％CO2孵育箱中孵育72小时。完毕后用CellTiter-Glo发光细胞活力试剂测试细胞活力，用PerkinElmer EnVision仪器测量发光度，并用GraphPad Prism9.0计算抑制率和EC50值(每种条件下n＝3)
实验结果：
对表1所示28个化合物进行抗流感活性筛选，其抑制活性数据见表2和表3。阳性对照药为盐酸阿比多尔(Arbidol Hydrochloride)。
表2一个浓度下目标化合物对流感病毒的抑制率
表3目标化合物抑制流感病毒的EC50值和CC50值
a体外引起50％个体有效的药物浓度。
如表2和表3所示，3个目标化合物对于流感病毒表现出较好的抑制活性，EC50值在6.55～12.45μM之间。其中，尤其以化合物A-1的活性最高(EC50＝9.86±0.67μM)，与阳性对照盐酸阿比多尔(EC50＝6.36±0.51μM)相当；化合物A-19细胞毒性(CC50＝316.3±157.74μM)显著低于盐酸阿比多尔(CC50＝198.53±39.43μM)。
实施例7：细胞水平流感病毒抑制活性测试实验
实验材料：
流感病毒血凝素H1和H3(购自Sino Biological Inc)
实验步骤：
方法为等温滴定量热法(ITC)。用PBS缓冲液将小分子化合物和HA蛋白按一定比例进行稀释。化合物溶液和HA蛋白的工作浓度分别为50、100、200、400、500和1000，进行梯度实验。设定仪器实验温度为25℃，参照功率为10，反馈等级为高，初始延迟为60s。向体积为270μL的样品池中注满配好的HA蛋白溶液，滴定针吸入各浓度化合物溶液40μL，然后以750r/min的转速搅拌，每间隔120s滴定针向HA样品池中注入一滴溶液，共19滴，参比池中加入Milli-Q超纯水作为热平衡对照。此外，分别进行化合物滴定缓冲液、缓冲液滴定HA溶液及缓冲液滴定缓冲液的对照实验，来达到扣除化合物与HA溶液的稀释热，上述所用溶液均在25℃下离心脱气以减小实验误差。实验结束后，由计算机自带数据处理软件MicroCalPEAQ-ITC Analysis Software，版本1.21中的独立结合位点(One set of sites)模型对数据进行非线性最小方差拟合，可得到小分子化合物与HA蛋白溶液作用的结合常数、摩尔结合焓、摩尔结合熵和吉布斯自由能。
实验结果：
对抑制率最高的三个化合物A-1、A-2和A-19进行药物-蛋白结合测定，具体KD值和热力学参数数据见表4。阳性对照药为盐酸阿比多尔(Arbidol Hydrochloride)
表4化合物与HA蛋白相互作用的KD值和热力学参数
a解离常数
b吉布斯自由能变
c反应熵变
d反应焓变
如表4所示，3个目标化合物都对HA蛋白产生了较好的结合力，KD值在1.04～2.23μM之间。其中，尤其以化合物A-1的结合最强(与H1和H3结合的KD值分别为1.59±0.38μM和1.70±0.33μM)，与阳性对照盐酸阿比多尔(与H1和H3结合的KD值分别为0.74±0.12μM和0.78±0.16μM)相当。
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