澜沧黄杉中不同萜类分子间加合物及其制备方法和制药用途
技术领域
本发明属医药
技术领域
，涉及澜沧黄杉中不同萜类分子间加合物及其制备方法和制药用途，具体涉及从松科植物澜沧黄杉(Pseudotsuga forrestii Craib)的枝叶中制得的不同萜类分子间Diels-Alder型加合物，以及该类化合物的制备方法，及该类化合物在制备作为ATP-柠檬酸裂解酶抑制剂中的用途，该ATP-柠檬酸裂解酶抑制剂用于防治ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)介导的糖脂代谢紊乱相关疾病，如高脂血症、非酒精性脂肪肝、II型糖尿病等。背景技术
现有技术公开了内源性胆固醇合成是体循环血浆胆固醇的关键来源，线粒体三羧酸循环(TCA cycle)产生的乙酰辅酶A是内源性胆固醇合成的源头底物。通常，三羧酸循环生成的乙酰辅酶A不能直接透过线粒体膜进入细胞浆，而是在线粒体中通过柠檬酸合成酶的作用生成柠檬酸，并通过线粒体膜上的柠檬酸转运体进入细胞质中，随后被分布于内质网上的ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)水解为乙酰辅酶A和草酰乙酸(Beigneux et al.,J.Biol.Chem.2004,279,9557-9564)；乙酰辅酶A作为胆固醇从头合成的底物，经过33步反应生成胆固醇。研究公开了人体ACL酶蛋白是由4个相同的120KDa亚基组成的同源四聚体，每个多肽链含有1101个氨基残基(Singh et al,J.Biol.Chem.1976,251,5254-5250)；由此可见，ACL与脂肪酸和胆固醇的合成密切相关，其表达的改变与高脂血症(hyperlipidemia)及其所引发的心血管疾病(Cardiovascular Diseases,CVDs)(Burkeetal.,Curr.Opin.Lipidol.2017,28,193-200；Pinkosky et al.,TrendsMol.Med.2017,23,1047-1063)密切相关；同时，甘油三脂的代谢异常也增加糖脂代谢紊乱相关疾病非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)和II型糖尿病(Type II Diabetes Mellitus,T2DM)的危险因素，因此，ACL还可作为非酒精性脂肪肝和II型糖尿病的潜在治疗靶点(Armstrong et al.,Hepatology2014,59,1174-1197；Cohen etal,Science 2011,332,1519-1523)。还有研究表明ACL与癌症的发生密切相关，脂类合成的增加为细胞生长和分裂提供必须的脂质，是癌症发生的重要标志之一，也是肿瘤发生的早期事件(Migita et al,Cancer Res.2008,68,8547-8554)。ACL作为乙酰辅酶A(脂肪酸从头合成的重要组成部分)的主要来源，抑制其活性能显著地抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡；因此，ACL作为抗癌的潜在靶点在近年被广泛研究(Granchi et al.,Eur.J.Med.Chem.2018,157,1276-1291；Zaidi et al.,Cancer Res.2012,72:3709-3714)。
综上，ACL作为新药靶已成为近年糖脂代谢紊乱疾病创新药物研究的热点。随着高通量筛选技术的广泛运用，已陆续发现较多种类的ACL小分子抑制剂，但目前尚未有ACL抑制剂得以成功上市。目前仅美国Esperion Therapeutics(ESPR)公司开发研制的ACL小分子抑制剂Bempedoic acid进入临床III期试验阶段，用于治疗高胆固醇血症和动脉粥样化性心血管疾病；其它ACL抑制剂，由于其低细胞穿透力、与ACL的低亲和力以及特异性不强等原因，研究受到限制。寻找高效、高选择性，同时兼具良好药代动力学性质的小分子ACL抑制剂具有重要意义，对于心血管疾病和癌症等疾病的治疗有着广阔的应用前景。
天然产物对于新药开发的指导和借鉴有着独特而重要地位，是新药发现的重要来源(Newman et al.,J.Nat.Prod.2016,79:629-661；Tiago et al.,Nat.Chem.2016,8:531-541)。天然产物是经自然法则长时间选择进化而产生的，往往能与生物大分子有效结合，可以被认为是与人类蛋白高度相关生物系统长年累月筛选淘汰后剩下的精英化合物库。同时，单一靶点的药物往往疗效不佳，而中药/植物药及其组分具有多靶点、多途径的作用特点，在治疗复杂疾病过程中具有独特优势。因此从天然来源(特别是植物来源)化学成分中寻找开发新型、高效、低毒副作用的ACL抑制剂具有重要的研究价值。具有独特来源和结构特征的天然产物可能可以在目前糖脂代谢紊乱疾病新药研发领域的激烈竞争中获得先机。
澜沧黄杉(Pseudotsuga forrestii Craib)属于松科(Pinaceae)黄杉属(Pseudotsuga)植物，为我国特有种植物，其为常绿乔木，分布于横断山脉中南部中山上部至高山中部，于1992年被《中国植物红皮书—稀有濒危植物》收录，被列为“渐危种”。目前，其化学成分尚未有任何报道，如果能保护性地去采集少许澜沧黄杉植物样品进行系统的化学成分研究，将会积极促进科学认识、积极保护和利用这一珍稀植物资源为人类服务。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供澜沧黄杉中不同萜类分子间加合物及其制备方法和制药用途。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，提供澜沧黄杉中不同萜类分子间加合物及其制备方法和制药用途。
本发明从澜沧黄杉枝叶的甲醇提取物中分离得到一系列具有新颖结构的不同萜类分子间Diels-Alder型加合物(结构如式1～式6所示)，经药理试验表明，该类化合物具有显著的ACL抑制活性，所述的化合物可用于制备ATP-柠檬酸裂解酶抑制剂，用于治疗高脂血症、非酒精性脂肪肝炎、II型糖尿病、癌症及其它ACL所介导的疾病。
本发明提供了所述的不同萜类分子间Diels-Alder型加合物的制备方法，
本发明从松科黄杉属植物澜沧黄杉(Pseudotsuga forrestii Craib)中分离鉴定出6个重排羊毛螺甾烷型三萜与不同萜类分子间通过Diels-Alder[4+2]环加成反应而产生的具有新骨架的化合物，其结构特征是重排羊毛螺甾烷型三萜与松香烷二萜骈合(C30-C20)或与月桂烷型单萜骈合(C30-C10)。
更具体的，本发明提供了选自以下的Diels-Alder型加合物：
本发明所述的化合物可通过从植物中分离纯化得到，也可经本领域技术人员熟知的化学方法合成获得。
本发明提供了所述的Diels-Alder型加合物的制备方法，其包括：
所述的化合物由澜沧黄杉(Pseudotsuga forrestii Craib)枝叶经提取分离方法制得，按如下步骤：晾干粉碎的澜沧黄杉枝叶用甲醇/水溶液室温浸泡提取，提取液减压浓缩回收溶剂，合并后得浸膏；浸膏用水分散后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水溶性部位；乙酸乙酯部位经硅胶、微孔树脂(MCI)、Sephadex LH-20及反相半制备高效液相(semi-preparative RP-HPLC)反复分离纯化，制得化合物1–6。
上述方法中，所述的甲醇/水溶液为70％以上的甲醇-水溶液，本发明中优选90％的甲醇-水溶液；室温提取的时间为12小时/次以上；提取次数为一次或多次，优选3次以上。
本发明的Diels-Alder型加合物在ACL抑制活性实验中，显示出较强的抑制作用，且活性与阳性对照BMS303141相当。
本发明进一步提供了上述化合物或组合物在制备治疗ACL所介导的疾病的药物中的用途。基于该类化合物在化学结构新颖性、生物活性的优点，使其具有很好的开发前景，有望坐为结构新颖的针对ACL所介导疾病的治疗药物或先导化合物。
本发明提供了一种药物组合，其采用上述Diels-Alder型加合物中的一种或多种作为原料，包含治疗有效量的选自上述化合物中的一种或多种作为活性成分，该组合物可以进一步包括药剂学上可接受的药物辅料，例如载体、赋形剂、佐剂或稀释剂等。所述药物组合可于制备预防、延缓或治疗由ACL介导的糖脂紊乱相关疾病特别是高血脂症及其相关的心血管疾病的药物或是作为该类药物的先导化合物。
本发明具有如下显著优点：
所述化合物为从自然界分离得到的新颖化合物，是具有独特[4+2]-型环化结构的Diels-Alder型加合物(三萜与二萜或三萜与单萜骈合)；同时该类化合物具有显著的ACL抑制活性；对现代人群中高发的糖脂代谢紊乱相关疾病如高脂血症、非酒精性脂肪肝炎、II型糖尿病等疾病具有重要应用前景。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明化合物制备步骤和药理实验过程。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围，本领域的技术人员可以对此做出种种修改和变化。
本发明中，澜沧黄杉(Pseudotsuga forrestii Craib)枝叶采自云南大理，经阴干后粉碎制成粉末；比旋光测试通过Rudolf Autopol IV旋光仪于25℃下完成；Hitachi U-2900E型紫外光谱仪；Thermo Scientific Nicolet Is5 FT-IR型红外光谱仪；ECD光谱由JASCO-810 CD光谱仪测定；单晶衍射实验所用仪器为Bruker D8 Venture衍射仪(镓靶)；ESI-MS由Agilent 1100型LC-MS仪测定,HR-ESIMS由AB Sciex TripleTOF 5600型仪测定；所使用的硅胶为青岛海洋化工公司生产；硅胶薄层板为烟台江友硅胶开发有限公司生产，规格为GF254/0.25mm；MCI gel CHP20P为日本三菱公司生产，规格为75-150μm；SephadexLH-20凝胶为瑞士GE Healthcare Bio-Sciences公司生产；半制备HPLC为Shimadzu LC-20AT，配备SPD-M20A PDA检测器以及Waters XBridge ODS和Cosmosil半制备柱(250×10mm,5μm)；所有分析纯试剂均为上海国药集团化学试剂有限公司生产；色谱级溶剂由上海星可高纯溶剂有限公司生产；氘代试剂为Sigma-Aldrich生产。
实施例1:制备本发明所述化合物
(1)将采自云南大理的澜沧黄杉枝叶(第一批次：2017年10月采集，干重13kg)干燥粉碎后，室温下使用90％甲醇(6L)溶液提取7次，每次24小时；
(2)将步骤(1)所得提取液合并，减压浓缩除去甲醇后得到浸膏2.46kg(semi-dry)，用水2L分散浸膏，依次使用等体积的石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇分别萃取三次，各萃取液经减压浓缩后分别得到石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水4个组分，其中，乙酸乙酯部分粗浸膏(409g)经硅胶柱色谱(以石油醚-乙酸乙酯梯度洗，30:1→0:1,v/v)分离后得到10个组分，Fr.1～Fr.10；(3)将步骤(2)中的组分Fr.5通过MCI柱色谱进行分离，以MeOH-H2O梯度洗脱(60:40→70:30→80:20→90:10→100:0,v/v)得到10个亚组分Fr.5A～Fr.5J，亚组分Fr.5H经硅胶层析后，再经反相HPLC进一步纯化(XBridge柱；流动相：MeOH/H2O,92:8,v/v；流速：3mL/min；柱温25℃，于205nm波长下检测)，收集13.0-15.0min洗脱液，减压浓缩收集洗脱液分别得化合物6(3.5mg)，将亚组分Fr.5I经凝胶柱色谱(SephadexLH-20)以纯甲醇洗脱后，再经反相HPLC进一步纯化(XBridge柱，5μm,250×10mm；流动相：MeCN/H2O,90:10,v/v；流速：3mL/min；柱温25℃，于205nm波长下检测)，收集18.0-22.0min洗脱液，减压浓缩收集洗脱液分别得化合物5(3.9mg)；
(4)将采自云南大理的两批澜沧黄杉枝叶(第二批次：2019年6月采集，干重15kg)干燥粉碎后，室温下使用90％甲醇(6L)溶液提取7次，每次24小时。提取液合并，减压浓缩除去甲醇后得到浸膏3.9kg(semi-dry)，用水3L分散浸膏，依次使用等体积的石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇各萃取三次，各萃取液经减压浓缩后分别得到石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水4个组分，其中，乙酸乙酯部分粗浸膏经硅胶柱色谱(以石油醚-乙酸乙酯梯度洗，30:1→0:1,v/v)分离后得到8个组分，Fr.1～Fr.8；
(5)以HPLC-MS指导分离，选择将步骤(4)中的组分Fr.3(44g)通过MCI柱色谱进行分离，以MeOH-H2O梯度洗脱(70:30→80:20→90:10→100:0,v/v)得到7个亚组分Fr.3A～Fr.3G。亚组分Fr.3F(2.7g)经凝胶柱色谱(Sephadex LH-20)以纯甲醇洗脱后，再经反相HPLC进一步纯化(流动相：MeOH/H2O96:4,v/v；流速：3mL/min；柱温25℃，于205nm波长下检测)，分别收集17.0-19.0min和30.0-33.0min洗脱液，减压浓缩收集洗脱液分别得化合物1(100.0mg)和化合物3(100.0mg)；
(6)将步骤(4)中的组分Fr.4(35g)通过MCI柱色谱进行分离，以MeOH-H2O梯度洗脱(70:30→80:20→90:10→100:0,v/v)得到5个亚组分Fr.4A～Fr.4E；以HPLC-MS指导分离，选择亚组分Fr.4C(6.6g)经反相HPLC进一步纯化(流动相：MeOH/H2O95:5,v/v；流速：3mL/min；柱温25℃，于205nm波长下检测)，分别收集26.0-28.0min和29.0-31.0min洗脱液，减压浓缩收集洗脱液分别得化合物2(8.0mg)和化合物4(10.0mg)。
化合物1，其核磁及理化数据如下：
片状单晶，+55.4(c0.27,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)206(3.57)nm；IR(KBr)vmax2952,2870,2649,1695,1469,1387,1273,1116,935,882,761cm-1；1H-NMR(CDCl3,600MHz):δ1.62(1H,m,H-1a),1.96(1H,m,H-1b),2.41(1H,m,H-2a),2.65(1H,m,H-2b),1.57(1H,m,H-5),1.63(1H,m,H-6a),1.44(1H,m,H-6b),1.93(2H,m,H-7),2.13(1H,m,H-11a),2.12(1H,m,H-11b),1.40(2H,m,H-12),2.39(1H,m,H-15a),2.27(1H,m,H-15b),1.92(1H,m,H-16a),1.46(1H,m,H-16b),0.77(3H,s,H-18),1.11(3H,s,H-19),2.38(1H,m,H-20),0.74(3H,d,J＝6.5Hz,H-21),2.44(1H,m,H-22a),2.05(1H,m,H-22b),2.79(1H,br s,H-24),1.17(3H,s,H-26),1.09(6H,br s,H-29,30),4.72(1H,br s,H-30a),4.46(1H,br s,H-30b),0.76(1H,m,H-1'a),1.45(1H,m,H-1'b),1.56(1H,m,H-2'a),1.46(1H,m,H-2'b),1.61(1H,m,H-3'a),1.54(1H,m,H-3'b),1.69(1H,m,H-5'),1.58(1H,m,H-6'a),1.33(1H,m,H-6'b),1.59(2H,m,H-7'),1.61(1H,m,H-9'),2.12(1H,m,H-11'a),1.04(1H,m,H-11'b),2.76(1H,br s,H-12'),5.36(1H,s,H-14'),2.34(1H,m,H-15'),1.04(6H,br d,J＝6.5Hz,H-16’,17’),1.16(3H,s,H-18’),0.62(3H,s,H-20')；13C-NMR(CDCl3,150MHz):δ35.8(C-1),34.6(C-2),216.7(C-3),47.4(C-4),51.4(C-5),20.9(C-6),26.0(C-7),136.1(C-8),147.9(C-9),35.9(C-10),26.8(C-11),30.9(C-12),67.9(C-13),154.3(C-14),27.0(C-15),38.1(C-16),48.1(C-17),18.3(C-18),18.8(C-19),36.3(C-20),15.4(C-21),44.8(C-22),213.8(C-23),62.2(C-24),49.8(C-25),18.5(C-26),184.2(C-27),21.2(C-28),26.3(C-29),103.7(C-30),38.2(C-1'),17.0(C-2'),37.3(C-3'),46.9(C-4'),48.4(C-5'),22.0(C-6'),30.9(C-7'),45.8(C-8'),49.0(C-9'),37.5(C-10'),20.3(C-11'),34.7(C-12'),149.4(C-13'),125.2(C-14'),32.3(C-15'),20.1(C-16'),20.2(C-17'),16.0(C-18'),186.6(C-19'),17.3(C-20')；ESIMS m/z 769[M+H]+；HRESIMS m/z 769.5392[M+H]+(calcdfor C50H73O6,769.5402,Δ＝+1.02ppm).
化合物2，其核磁及理化数据如下：
白色无定形粉末，+26.4(c0.35,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)206(3.67)nm；IR(KBr)vmax2950,2927,2870,1688,1464,1379,1277,1108,881,759cm-1；1H-NMR(CDCl3,600MHz):δ1.71(1H,m,H-1a),1.89(1H,m,H-1b),2.49(1H,m,H-2a),2.61(1H,m,H-2b),1.66(1H,m,H-5),1.74(1H,m,H-6a),1.54(1H,m,H-6b),1.94(2H,m,H-7),2.16(1H,m,H-11a),2.05(1H,m,H-11b),1.41(1H,m,H-12a),1.36(1H,m,H-12b),2.38(1H,m,H-15a),2.30(1H,m,H-15b),1.83(1H,m,H-16a),1.47(1H,m,H-16b),0.84(3H,s,H-18),1.08(3H,s,H-19),2.37(1H,m,H-20),0.80(3H,d,J＝6.5Hz,H-21),2.72(1H,d,J＝17.8Hz,H-22a),2.06(1H,m,H-22b),3.35(1H,br s,H-24),0.83(3H,s,H-26),1.11(3H,s,H-29),1.08(3H,s,H-30),4.73(1H,br s,H-30a),4.48(1H,br s,H-30b),0.83(1H,m,H-1'a),1.39(1H,m,H-1'b),1.60(1H,m,H-2'a),1.45(1H,m,H-2'b),1.48(1H,m,H-3'a),1.45(1H,m,H-3'b),1.48(1H,m,H-5'),2.04(1H,m,H-6'a),1.38(1H,m,H-6'b),2.04(1H,m,H-7'a),1.38(1H,m,H-7'b),2.11(1H,m,H-9'),1.52(1H,m,H-11'a),1.08(1H,m,H-11'b),2.54(1H,m,H-12'),5.37(1H,s,H-14'),2.67(1H,m,H-15'),1.13(3H,d,J＝6.5Hz,H-16’),1.05(3H,d,J＝6.5Hz,H-17’),1.16(3H,s,H-18’),0.63(3H,s,H-20')；13C-NMR(CDCl3,150MHz):δ35.9(C-1),34.4(C-2),218.1(C-3),47.2(C-4),51.0(C-5),21.1(C-6),26.4(C-7),136.6(C-8),147.5(C-9),35.9(C-10),26.7(C-11),31.6(C-12),68.0(C-13),155.3(C-14),27.2(C-15),38.0(C-16),48.8(C-17),19.2(C-18),18.5(C-19),33.4(C-20),16.0(C-21),44.6(C-22),210.9(C-23),59.0(C-24),55.8(C-25),16.5(C-26),183.2(C-27),21.1(C-28),26.5(C-29),103.9(C-30),38.0(C-1'),16.9(C-2'),35.9(C-3'),46.6(C-4'),49.3(C-5'),21.5(C-6'),32.0(C-7'),45.5(C-8'),47.6(C-9'),35.5(C-10'),29.5(C-11'),36.5(C-12'),148.2(C-13'),124.7(C-14'),32.2(C-15'),19.9(C-16'),21.1(C-17'),16.9(C-18'),185.2(C-19'),16.3(C-20')；ESIMS m/z 769[M+H]+；HRESIMS m/z 769.5406[M+H]+(calcdfor C50H73O6,769.5402,Δ＝+0.6ppm).
化合物3，其核磁及理化数据如下：
白色无定形粉末，+58.9(c0.27,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)206(3.67)nm；IR(KBr)vmax3070,2955,2937,2870,2651,1698,1462,1379,1276,1197,759cm-1；1H-NMR(CDCl3,600MHz):δ1.71(1H,m,H-1a),1.94(1H,m,H-1b),2.49(1H,m,H-2a),2.67(1H,m,H-2b),1.68(1H,m,H-5),1.76(1H,m,H-6a),1.68(1H,m,H-6b),2.26(2H,m,H-7),2.05(2H,m,H-11),1.67(1H,m,H-12a),1.45(1H,m,H-12b),2.40(1H,m,H-15a),2.21(1H,m,H-15b),1.52(1H,m,H-16a),1.44(1H,m,H-16b),0.91(3H,s,H-18),1.12(3H,s,H-19),2.38(1H,m,H-20),0.87(3H,d,J＝6.5Hz,H-21),2.66(1H,m,H-22a),2.24(1H,m,H-22b),3.16(1H,d,J＝17.6Hz,H-24a),2.63(1H,d,J＝17.6Hz,H-24b),2.34(1H,m,H-26a),0.95(1H,m,H-26b),1.14(3H,s,H-28),1.09(3H,s,H-29),4.77(1H,br s,H-30a),4.53(1H,br s,H-30b),0.84(1H,m,H-1'a),1.43(1H,m,H-1'b),1.55(1H,m,H-2'a),1.46(1H,m,H-2'b),1.64(2H,m,H-3'),1.54(1H,m,H-5'),1.49(1H,m,H-6'a),1.29(1H,m,H-6'b),2.06(2H,m,H-7'),1.68(1H,m,H-9'),1.14(1H,m,H-11'a),1.33(1H,m,H-11'b),2.49(1H,m,H-12'),5.21(1H,s,H-14'),2.36(1H,m,H-15'),1.03(3H,d,J＝6.5Hz,H-16'),1.04(3H,d,J＝6.5Hz,H-17’),1.12(3H,s,H-18’),0.62(3H,s,H-20')；13C-NMR(CDCl3,150MHz):δ35.6(C-1),34.5(C-2),217.4(C-3),47.3(C-4),51.0(C-5),20.7(C-6),26.7(C-7),136.2(C-8),147.9(C-9),36.0(C-10),26.3(C-11),32.1(C-12),68.2(C-13),155.7(C-14),27.2(C-15),37.8(C-16),49.4(C-17),18.7(C-18),19.0(C-19),34.0(C-20),16.3(C-21),45.2(C-22),209.1(C-23),50.7(C-24),50.8(C-25),40.0(C-26),181.4(C-27),21.0(C-28),26.5(C-29),104.1(C-30),38.4(C-1'),17.1(C-2'),36.9(C-3'),47.0(C-4'),49.1(C-5'),22.0(C-6'),32.8(C-7'),42.9(C-8'),49.3(C-9'),38.0(C-10'),27.5(C-11'),32.7(C-12'),149.4(C-13'),123.5(C-14'),32.7(C-15'),20.2(C-16'),20.3(C-17'),16.3(C-18'),185.6(C-19'),16.7(C-20')；ESIMS m/z 769[M+H]+；HRESIMS m/z 769.5403[M+H]+(calcd forC50H73O6,769.5402,Δ＝-0.1ppm).
化合物4，其核磁及理化数据如下：
针状单晶(CHCl3),+13.9(c0.336,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)206(3.67)nm；IR(KBr)vmax2960,2922,2870,1693,1462,1382,1270,1110,928,878,754,686,569cm-1；1H-NMR(CDCl3,600MHz):δ1.70(1H,m,H-1a),1.92(1H,m,H-1b),2.47(1H,m,H-2a),2.61(1H,m,H-2b),1.65(1H,m,H-5),1.68(1H,m,H-6a),1.56(1H,m,H-6b),2.11(1H,m,H-7a),1.95(1H,m,H-7b),2.14(1H,m,H-11a),1.71(1H,m,H-11b),2.04(1H,m,H-12a),1.44(1H,m,H-12b),2.42(1H,m,H-15a),2.34(1H,m,H-15b),1.53(1H,m,H-16a),1.44(1H,m,H-16b),0.83(3H,s,H-18),1.05(3H,s,H-19),2.31(1H,m,H-20),0.77(3H,d,J＝6.5Hz,H-21),2.55(1H,dd,J＝14.0,2.6Hz,H-22a),2.02(1H,m,H-22b),3.16(1H,d,J＝18.5Hz,H-24a),2.23(1H,d,J＝18.5Hz,H-24b),2.71(1H,dd,J＝17.6,14.0,3.4Hz,H-26a),0.82(1H,m,H-26b),1.12(3H,s,H-28),1.09(3H,s,H-29),4.75(1H,br s,H-30a),4.50(1H,br s,H-30b),0.83(1H,m,H-1'a),1.40(1H,m,H-1'b),1.51(1H,m,H-2'a),1.39(1H,m,H-2'b),1.64(2H,m,H-3'),1.57(1H,m,H-5'),1.48(1H,m,H-6'a),1.36(1H,m,H-6'b),1.81(1H,m,H-7'a),1.77(1H,m,H-7'b),1.62(1H,m,H-9'),1.10(1H,m,H-11'a),1.71(1H,m,H-11'b),2.46(1H,m,H-12'),5.31(1H,s,H-14'),2.31(1H,m,H-15'),1.02(3H,d,J＝6.5Hz,H-16’),1.00(3H,d,J＝6.5Hz,H-17’),1.15(3H,s,H-18’),0.60(3H,s,H-20')；13C-NMR(CDCl3,150MHz):δ35.6(C-1),34.5(C-2),218.0(C-3),47.2(C-4),51.0(C-5),20.6(C-6),26.7(C-7),136.1(C-8),147.8(C-9),35.9(C-10),26.3(C-11),32.8(C-12),68.1(C-13),155.8(C-14),27.3(C-15),37.8(C-16),49.3(C-17),18.6(C-18),18.5(C-19),35.2(C-20),16.1(C-21),44.9(C-22),210.4(C-23),51.5(C-24),53.3(C-25),39.4(C-26),180.5(C-27),21.1(C-28),26.6(C-29),104.1(C-30),38.0(C-1'),17.1(C-2'),37.2(C-3'),46.5(C-4'),48.6(C-5'),22.0(C-6'),31.2(C-7'),43.3(C-8'),49.9(C-9'),37.8(C-10'),26.6(C-11'),33.1(C-12'),150.5(C-13'),124.3(C-14'),32.6(C-15'),20.5(C-16'),20.3(C-17'),16.7(C-18'),184.3(C-19'),16.6(C-20')；ESIMS m/z 769[M+H]+；HRESIMS m/z 769.5415[M+H]+(calcdfor C50H73O6,769.5402,Δ＝+1.7ppm)..
化合物5，其核磁及理化数据如下：
白色无定形粉末，+15.5(c0.39,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)206(3.48)nm；IR(KBr)vmax3369,2967,2935,2848,1706,1462,1382,1250,1122,1030,891cm-1；1H-NMR(CDCl3,600MHz):δ1.70(1H,m,H-1a),1.91(1H,m,H-1b),2.49(1H,ddd,J＝16.2,7.5,3.4Hz,H-2a),2.58(1H,ddd,J＝16.2,10.5,7.5Hz,H-2b),1.69(1H,br d,overlapped,H-5),1.76(1H,dd,J＝13.0,6.0Hz,H-6a),1.58(1H,m,H-6b),2.00(1H,m,H-7a),2.08(1H,m,H-7b),2.08(1H,m,H-11a),2.00(1H,m,H-11b),1.91(1H,dd,J＝7.5,3.4Hz,H-12a),1.36(1H,dd,J＝12.2,7.5Hz,H-12b),2.40(1H,m,H-15a),2.34(1H,m,H-15b),1.56(1H,m,H-16a),1.49(1H,m,H-16b),0.90(3H,s,H-18),1.06(3H,s,H-19),2.44(1H,m,H-20),0.81(3H,d,J＝6.5Hz,H-21),2.65(1H,d,J＝16.0Hz,H-22a),2.38(1H,m,H-22b),3.04(1H,dd,J＝12.1,5.3Hz,H-24),1.23(3H,s,H-26),1.13(3H,s,H-28),1.07(3H,s,H-29),4.75(1H,brs,H-30a),4.49(1H,br s,H-30b),2.25(1H,m,H-1'a),1.92(1H,m,H-1'b),5.39(1H,br s,H-3'),2.38(1H,m,H-4'a),2.02(1H,m,H-4'b),2.09(1H,m,H-5'a),2.01(1H,m,H-5'b),2.26(2H,m,H-6'),5.04(1H,t,J＝6.7Hz,H-7'),1.68(3H,s,H-9'),1.60(3H,s,H-10')；13C-NMR(CDCl3,150MHz):δ35.5(C-1),34.4(C-2),217.3(C-3),47.1(C-4),51.0(C-5),20.8(C-6),26.2(C-7),136.5(C-8),147.7(C-9),35.8(C-10),26.2(C-11),31.7(C-12),68.0(C-13),154.9(C-14),27.1(C-15),38.0(C-16),48.6(C-17),18.9(C-18,19),33.5(C-20),15.8(C-21),43.4(C-22),211.3(C-23),52.4(C-24),42.3(C-25),182.4(C-26),15.7(C-27),26.7(C-28),20.9(C-29),103.8(C-30),28.6(C-1'),135.1(C-2'),118.8(C-3'),37.6(C-4'),37.1(C-5'),26.7(C-6'),123.5(C-7'),132.0(C-8'),25.7(C-9'),17.7(C-10')；ESIMS m/z 625[M+Na]+；HRESIMS m/z 625.4205[M+Na]+(calcd for C40H58O4Na,625.4227,Δ＝-3.5ppm).
化合物6，其核磁及理化数据如下：
白色无定形粉末，+9.1(c0.15,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)206(3.84)nm；IR(KBr)vmax3449,2932,2878,1716,1462,1387,1295,1182,1078,1035cm-1；1H-NMR(CDCl3,600MHz):δ1.28(1H,ddd,J＝14.8,14.6,3.6Hz,,H-1a),1.67(1H,m,H-1b),1.73(1H,m,H-2a),1.62(1H,m,H-2b),3.29(1H,dd,J＝12.1,4.4Hz,H-3),1.10(1H,br d,J＝11.4Hz,H-5),1.82(1H,m,H-6a),1.50(1H,m,H-6b),1.91(1H,m,H-7a),2.19(1H,m,H-7b),2.08(1H,m,H-11a),1.99(1H,m,H-11b),1.87(1H,m,H-12a),1.36(1H,m,H-12b),2.40(1H,m,H-15a),2.30(1H,m,H-15b),1.55(1H,m,H-16a),1.46(1H,m,H-16b),0.87(3H,s,H-18),0.96(3H,s,H-19),2.41(1H,m,H-20),0.79(3H,d,J＝5.8Hz,H-21),2.67(1H,br d,J＝15.2Hz,H-22a),2.38(1H,m,H-22b),3.03(1H,dd,J＝11.7,4.4Hz,H-24),1.22(3H,s,H-26),1.03(3H,s,H-28),0.82(3H,s,H-29),4.73(1H,br s,H-30a),4.49(1H,br s,H-30b),2.27(1H,dd,overlapped,H-1'a),1.92(1H,dd,overlapped,H-1'b),5.38(1H,br s,H-3'),2.39(1H,brd,overlapped,,H-4'a),2.04(1H,br d,overlapped,,H-4'b),2.08(1H,m,H-5'a),2.00(1H,m,H-5'b),2.24(2H,m,H-6'),5.06(1H,t,J＝6.8Hz,H-7'),1.68(3H,s,H-9'),1.60(3H,s,H-10')；13C-NMR(CDCl3,150MHz):δ35.4(C-1),27.7(C-2),79.0(C-3),38.7(C-4),50.9(C-5),19.4(C-6),27.0(C-7),135.3(C-8),149.6(C-9),36.1(C-10),26.2(C-11),31.7(C-12),68.0(C-13),155.0(C-14),27.1(C-15),38.0(C-16),48.5(C-17),18.8(C-18),19.5(C-18),33.5(C-20),15.8(C-21),43.4(C-22),211.4(C-23),52.4(C-24),42.3(C-25),182.4(C-26),15.7(C-27),28.0(C-28),15.3(C-29),103.7(C-30),28.5(C-1'),135.2(C-2'),118.7(C-3'),37.6(C-4'),37.1(C-5'),26.3(C-6'),123.6(C-7'),131.9(C-8'),25.7(C-9'),17.7(C-10')；ESIMS m/z 627[M+Na]+；HRESIMS m/z 627.4356[M+Na]+(calcd for C40H60O4Na,627.4384,Δ＝-4.5ppm).。
实例2：本发明制得的化合物的ACL抑制活性测试
实验方法：本实验中ACL能将柠檬酸催化转变为乙酰辅酶A，进而产生脂肪酸合成的前体分子－丙二酸单酰辅酶A，该反应伴随ATP的消耗，因此可以使用ADP-Glo和激酶检测试剂盒检测ATP的变化，间接反应化合物对ACL酶活性的抑制作用；本实施例中，初筛选择所述化合物浓度为20μg/ml时对ACL酶活性的百分抑制率进行考察，试验结果表明上述化合物均有酶活抑制作用；
进一步测定IC50值：样品临用前溶于DMSO配成合适浓度，3倍稀释，7个稀释度，三复孔，取2μL样品溶液加入到标准的测活体系(40mMTris,pH8.0,10mMMgCl2,5mMDTT,ATP,CoA,柠檬酸钠和ACL)，37℃下孵育30min；而后，体系内加入25μLADP-Glo试剂，室温下孵育30min，以终止反应，并消耗完剩余的ATP；再加入激酶检测试剂孵育30min后，其荧光信号由EnVision读出，其动力学曲线一级反应的斜率作为酶的活性指标；以相对活性对化合物浓度作图，经公式v/v0＝100/(1+b*[I]/IC50)拟合得到IC50值，实验重复三次，结果取三次的平均值；阳性对照BMS303141的IC50值为0.20±0.04μM。
表1为澜沧黄杉中Diels-Alder型萜类加合物的ACL抑制活性数据。
表1.
测试结果如表1的Diels-Alder型萜类加合物的ACL抑制活性数据(IC50值)所示，所述的6个化合物均对ACL表现出显著的抑制活性，表明本发明所述的化合物可用于制备治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的药物或是作为该类药物的先导化合物。
