一种稳定同位素氨基化合物标记试剂及其合成方法与应用
技术领域
本发明涉及稳定同位素标记
技术领域
，尤其涉及一种稳定同位素氨基化合物标记试剂及其合成方法与应用。背景技术
本发明
背景技术
中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。高效液相色谱-质谱串联技术(HPLC-MS/MS)由于其高灵敏度和高选择性而被广泛应用于生命分析、环境检测、食品评估等研究领域。采用HPLC-MS/MS的选择反应监测(SRM)或多级反应离子监测(MRM)模式可以选择性的监测样品中的靶向以及半靶向分析物。然而，基质效应的存在使HPLC-MS/MS的分析性能大打折扣。
近年来，稳定的同位素编码技术受到了很大的关注，尤其是稳定同位素编码衍生技术，借助轻/重同位素编码衍生试剂，可获得具有相同官能团的一类分析物的同位素衍生物，通常以重型同位素衍生物作为内标物进行HPLC-MS/MS定量分析，可以有效地校准基质效应的影响。然而，目前的化学标记方法或多或少地存在一些缺陷，如标记反应速率慢、标记产率低、标记产物信号弱、标记准确性和灵敏性较差等，并且很多标记试剂的合成复杂，不易获得相应的同位素产物，因此限制了它们的广泛使用。
发明内容
针对上述的问题，本发明提供一种稳定同位素氨基化合物标记试剂及其合成方法与应用，该标记试剂具有标记反应速率快、标记产物信号高、质谱检测氨基化合物准确性强和灵敏性高且合成简便的特点。为实现上述目的，本发明公开如下的技术方案：
在本发明的第一方面，提供一种稳定同位素氨基化合物标记试剂，其化学名称为：[d4]-2-(9-吖啶酮)-乙基氯甲酸酯，该标记试剂的化学结构式如式1所示：
其中：X＝D(即氢的同位素氘)，该标记试剂为[d4]-2-(9-吖啶酮)-乙基氯甲酸酯，简写为AEC-R-[d4]。
进一步地，所述式1中R为F(氟)、Cl(氯)、Br(溴)、I(碘)等元素中的任意一种，优选为Cl元素，其中酰氯稳定易得。
进一步地，所述式1中n＝2或3，碳链的长度不宜过长，过长易导致衍生试剂结构不稳定。
在本发明的第二方面，提供所述稳定同位素氨基化合物标记试剂的合成方法，包括如下步骤：
(1)提供中间体I：[d5]-N-苯基邻氨基苯甲酸。
(2)中间体II的合成：将所述中间体I溶解于浓硫酸，加热反应后冷却，将冷得到的却液倒入沸水中，分离出析出的固体产物，洗涤该固体产物后干燥，得中间体II：[d4]-吖啶酮。
(3)中间体III的合成：将中间体II、碳酸乙烯酯溶解到二甲基亚砜中，然后加入氢氧化钾，加热反应后冷却，将得到的冷却液倒入食盐水溶液中，分离出析出的固体产物，洗涤该固体产物后干燥，然后重结晶，得中间体III：[d0/d4]-2-(9-吖啶酮)乙醇。
(4)冷却条件下，在溶解有固体光气的溶液中滴加三乙胺；然后加入溶解有所述中间体III的溶液，反应结束后分离出固体产物，即得化学结构式如式1所示的标记试剂。
进一步地，步骤(1)中，所述中间体I的合成包括步骤：
(i)将邻氨基苯甲酸、铜粉和碳酸钾溶解到二甲基亚砜中，混合均匀后加入氘代溴苯-d5，然后加热反应，结束后对反应液过滤，收集滤液。
(ii)将滤液倒入水中，用浓盐酸调至pH值5～6，将析出的固体过滤并干燥，即得中间体I。
进一步地，步骤(i)中，所述加热反应采用油浴加热，加热温度为145～150℃。
进一步地，步骤(i)中，所述邻氨基苯甲酸与氘代溴苯-d5的摩尔比为1～1.5:1；所述铜粉添加量为邻氨基苯甲酸与氘代溴苯-d5总摩尔量的0.05～0.1倍；所述碳酸钾添加量为邻氨基苯甲酸与氘代溴苯-d5总摩尔量的1.1～1.5倍，其中，所述铜粉添为催化剂，所述碳酸钾为缚酸剂。
进一步地，步骤(2)中，所述加热反应的温度为95～100℃，反应时间为1.5～2.5h。
进一步地，步骤(3)中，所述中间体II与碳酸乙烯酯摩尔比为1:1.2～1.5。
进一步地，步骤(3)中，所述氢氧化钾的添加量为碳酸乙烯酯摩尔量的0.01～0.04倍，氢氧化钾的主要作用是促使碳酸乙烯酯发生水解，
进一步地，步骤(3)中，所述加热反应采用油浴加热，加热温度为140～150℃，反应时间为5～6.5h。
进一步地，步骤(3)中，用乙腈重结晶得淡黄色晶体，即中间体III。
进一步地，步骤(4)中，将固体光气溶解于二氯甲烷中，即得溶解有固体光气的溶液。
进一步地，步骤(4)中，所述三乙胺的加入量为固体光气质量的2.7～3.5％。
进一步地，步骤(4)中，所述中间体III与固体光气的摩尔比为1:1.8～2.3。
进一步地，步骤(4)中，所述反应先在冰浴中进行4h，然后升到室温继续反应5小时，反应结束后对反应液进行抽滤，滤液用旋转蒸发仪减压蒸干，并用乙腈重结晶，得到式1所示的标记试剂。
在本发明的第三方面，公开所述稳定同位素氨基化合物标记试剂在生命分析、环境分析、食品分析等研究领域中的应用，优选为用于检测待测物中生物胺浓度。
进一步地，所述检测待测物中生物胺的浓度的方法包括步骤：
S1：配制硼砂/硼酸缓冲溶液、配制[d0]-2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯的乙腈溶液作为轻型标记试剂(X＝H)溶液、配制[d4]-2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯的乙腈溶液作为重型标记试剂(X＝D)溶液。
S2：依次将所述硼砂/硼酸缓冲溶液、含有生物胺的待测样品、轻型标记试剂溶液混合后反应，得反应液a。
S3：依次将所述硼砂/硼酸缓冲溶液、含有生物胺的待测样品、重型标记试剂溶液混合后反应，得反应液b。
S4：将所述反应液a和反应液b等体积混合，然后采用HPLC-MS/MS分析：轻型标记试剂衍生后所得轻型衍生物的峰面积表示为A1，生物胺的浓度表示为C1；重型标记试剂衍生后所得重型衍生物的峰面积记为A2，生物胺的浓度表示为C2，则根据公式C1/C2＝A1/A2，即可求得样品中生物胺的浓度。
进一步地，所述[d0]-2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯的获取可参考申请号为]CN202010117911.8，名称为“一种吖啶酮类荧光胺类化合物标记试剂及其合成方法与应用”的中国专利文献。
进一步地，所述硼砂/硼酸缓冲溶液的pH＝9.5，在该浓度范围内可迅速标记氨基化合物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的同位素标记试剂以吖啶酮为母体环与同位素标记基团，以氯甲酸酯为反应基团，利用酰氯与氨基化合物的快速反应原理，通过调节pH值，反应时间，可选择性地标记氨基化合物，而且具有合成方法简便、标记反应速率快、标记产物的信号强、标记产率高、对氨基选择性高的优点，增强质谱检测氨基化合物准确性和灵敏性等优点。
(2)本发明得到的这种同位素氘代标记试剂的同位素标记位置稳定，化学纯度达99.5％以上，同位素丰度在99.0％以上，这种标记试剂在硼砂/硼酸缓冲溶液中可以迅速标记氨基化合物，对氨基化合物表现出高的灵敏性和优秀的选择性，实现对氨基化合物的绝对定量，检测氨基化合物简便、灵敏、快速，结果准确。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1是本发明第一实施例制备的重型标记试剂的核磁1HNMR图谱。
图2是本发明第二实施例制备的轻型标记试剂的核磁1HNMR图谱。
图3是本发明实施例检测到的生物胺标准品的MRM离子色谱流图。
图4是本发明实施例中尸胺的轻型衍生物的二级质谱图。
具体实施方式
在接下来的描述中进一步阐述了本发明的具体细节用于充分理解本发明。本发明中的说明书所使用的术语只是为了用于说明本发明的优点和特点，不是旨在于限制本发明。
除非另行定义，本发明中所使用的所有专业与科学术语属于本发明的技术领域的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本发明所使用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方法。
正如前文所述，目前的化学标记方法或多或少地存在一些缺陷，如标记反应速率慢、标记产率低、标记产物信号弱、标记准确性和灵敏性较差等，并且很多标记试剂的合成复杂，不易获得相应的同位素产物。为此，本发明提出了一种稳定同位素氨基化合物标记试剂及其合成方法，现根据说明书附图和具体实施方式对该方法作进一步说明。
第一实施例
参考下述路线1(其中，X＝D)进行重型标记试剂[d4]-2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯的合成，包括如下步骤：
1、中间体I：[d5]-N-苯基邻氨基苯甲酸的制备：
向250mL三颈烧瓶中加入20g邻氨基苯甲酸，1g铜粉和10g碳酸钾，然后加入150mL二甲基亚砜作溶剂，搅拌混合均匀，再向得到的混合液中加入15g氘代溴苯-d5，然后在150℃油浴中搅拌反应5小时(邻氨基苯甲酸与氘代溴苯-d5进行取代反应)。
反应结束后，过滤，除掉多余铜粉和碳酸钾，收集滤液。将滤液倒入200mL的清水中，用浓盐酸调至pH值5，充分搅拌，待析出固体产物完全后进行过滤，将得到的固体产物置于烘箱中在50℃下烘干至恒重，得到17.1g灰色粉末状的产物，即中间体I：[d5]-N-苯基邻氨基苯甲酸，测得该产物的产率为83％。
2、中间体II：[d4]-吖啶酮的制备：
取15g上一步骤合成的中间体I溶于40mL浓硫酸(98wt.％)中，充分搅拌溶解，油浴加热并控制反应温度在100℃，搅拌反应2小时(中间体I在浓硫酸中加热合环)。
反应完成后冷却至室温，然后将冷却的反应液沿烧杯壁慢慢倒入300mL沸水中，并搅拌5分钟，待析出固体产物完全后，过滤出处固体产物，将该固体产物水洗两次，然后用5％的碳酸钾溶液煮沸洗涤两次，得到12g绿色粉末状的产物，即中间体II：[d4]-吖啶酮，得该产物的产率为85.2％。
3、中间体III：[d4]-2-(9-吖啶酮)乙醇的制备：
向250mL三口烧瓶中加入5g上一步骤合成的中间体II、3g碳酸乙烯酯和0.25g的氢氧化钾，然后加入100mL二甲基亚砜，搅拌溶解后在150℃反应4小时(中间体II与碳酸乙烯酯进行取代反应)。
反应结束后待反应液冷却至室温，将其倒入200mL的食盐水溶液中，并不断搅拌，可见淡黄色固体析出，抽滤后将得到的淡黄色固体产物水洗两次，得到粗产物；晾干后用乙腈重结晶2次，得到淡黄色晶体，即中间体III：[d4]-2-(9-吖啶酮)乙醇，得该产物的产率为80％。
4、目标产物：[d4]-2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯的制备：
向500mL的单口圆底烧瓶中加入5g固体光气，100mL二氯甲烷，冰浴冷却搅拌条件下加50μL三乙胺，然后继续缓慢滴加溶解有上一步骤制备的中间体III的二氯甲烷溶液，反应4小时后自然升到室温继续反应5小时(中间体III与固体光气进行酰化反应)。
反应结束后对反应液进行抽滤，滤液用旋转蒸发仪减压蒸干，并用乙腈重结晶3次，得到目标产物A，即重型标记试剂：[d4]-2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯，测得目标产物的产率为74％。
对本实施例合成的目标产物A进行表征，其核磁1H NMR图谱如图1所示：
1HNMR(500MHz,DMSO)δ8.36(dd,J＝8.0,1.7Hz,1H),7.92(d,J＝3.1Hz,1H),7.82(ddd,J＝8.7,6.9,1.8Hz,1H),7.33(s,1H),6.49(s,4H),4.61(t,J＝6.3Hz,2H),3.90(t,J＝6.3Hz,2H).
13CNMR(126MHz,DMSO)δ176.97,142.58,134.43,127.00,122.02,121.68,116.91,58.70,48.05。
Found:C62.72,H2.69Cl11.75,N4.55,O15.65；Calculated:C62.95,H2.61Cl11.65,N4.59,O15.74.
MS:m/z:[M+H]+＝306.5.
可以看出，本实施例成功地合成了目标产物A，记为重型标记试剂：[d4]-2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯。
第二实施例
参考申请号为]CN202010117911.8，名称为“一种吖啶酮类荧光胺类化合物标记试剂及其合成方法与应用”的中国专利文献中的合成路线，制备轻型标记试剂[d0]-2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯，即目标产物B。
对本实施例合成的目标产物B进行表征，其核磁1H NMR图谱如图2所示：
1HNMR(500MHz,DMSO)δ8.36(dd,J＝8.0,1.5Hz,2H),7.92(d,J＝8.8Hz,2H),7.82(ddd,J＝8.7,7.0,1.6Hz,2H),7.33(t,J＝7.4Hz,2H),4.61(t,J＝6.3Hz,2H),3.90(t,J＝6.3Hz,2H).
13CNMR(126MHz,DMSO)δ176.96,142.44,142.32,134.39,126.99,122.02,121.65,116.88,58.59,48.03
Found:Found:C63.79,H3.99Cl11.79,N4.65,O15.95；Calculated:C63.69,H4.01Cl11.75,N4.64,O15.91.
MS:m/z:[M+H]+＝302.1.
可以看出，本实施例成功地合成了目标产物B，记为轻型标记试剂：[d0]-2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯。
第三实施例
一种采用稳定同位素氨基化合物标记试剂检测待测物中生物胺浓度的方法，即：用所述第一实施例、第二实施例分别制备的重型标记试剂、轻型标记试剂进行生物胺的测试，具体如下：
第一步：配制pH＝9.5的硼砂/硼酸缓冲溶液；配制浓度为1×10-6mol/L的生物胺标准品乙腈溶液；配制浓度为1×10-4mol/L的[d0]-2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯的乙腈溶液作为轻型标记试剂溶液；配制浓度为1×10-4mol/L的[d4]-2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯的乙腈溶液作为重型标记试剂溶液，备用。
第二步：依次将200μL所述硼砂/硼酸缓冲溶液、100μL生物胺标准品溶液和50μL轻型标记试剂溶液加到2mL的安剖瓶中，于室温下反应5min，得反应液a。
第三步：依次将200μL所述硼砂/硼酸缓冲溶液、100μL生物胺标准品溶液和50μL重型标记试剂溶液经柱纯化后的果汁实际样品加到2mL的安剖瓶中，于室温下反应5min，得反应液b。
第四步：将所述反应液a和反应液b按体积比为1:1混合，进样1μL进行HPLC-MS/MS分析，其中：轻型标记试剂衍生后所得轻型衍生物的峰面积表示为A1，生物胺的浓度表示为C1；重型标记试剂衍生后所得重型衍生物的峰面积记为A2，果汁实际样品中生物胺的浓度表示为C2，则根据公式C1/C2＝A1/A2，即可求得果汁实际样品中生物胺的浓度。
标记试剂与生物胺反应为取代反应，其反应式如式2所示(其中，X＝H或D)。检测得到的8种生物胺标准品的MRM离子色谱流图如图3所示，其中，轻型和重型峰面积比值为5：1，在10分钟内即实现了8种生物胺分析物的完全分离，轻/重衍生物保留时间差异小于0.05分钟，完全符合质谱定量的要求。
可以看出，合成的这种同位素标记试剂以吖啶酮为母体环与同位素标记基团，以氯甲酸酯为反应基团，可选择性地标记氨基化合物，具有标记反应速率快、标记产物的信号强、标记产率高、对氨基选择性高的优点，增强质谱检测氨基化合物准确性和灵敏性等优点。吖啶酮的结构中的N原子碱性较弱但是N原子上面有电子，从而有利于衍生产物的离子化和质谱的灵敏定性，均可以在酸性条件下质子化，这具有极强的质谱增敏效果，将会在很大的程度上提高生物胺的检测灵敏度。
生物胺的定量采用安捷伦1290型超高效液相色谱系统，6460型三重四级杆串联质谱仪，配备电喷雾电离源(ESI)。色谱条件：流动相A为5％乙腈+95％水，流动相B为100％乙腈，流动相中添加浓度为0.1％的甲酸以增强分析物的离子化效率；采用梯度洗脱，设置流动相B初始梯度为30％，8min为100％，并保持5分钟；进样量为1μL，流速为0.2mL/min。质谱条件：ESI：正离子模式，干燥气温度：300℃，流速：10L/min，雾化压力：40psi，鞘气温度：250℃，流速：8L/min，毛细管电压：3.5KV。碰撞电压(Fragmentor)如表1所示。
表1碰撞电压和裂解能参数
衍生物均显示较强的[M+H]+信号，轻型衍生物主要产生m/z222.2与238.3的碎片离子，重型衍生物主要产生m/z226.2与242.3的碎片离子，以尸胺的轻型衍生物为代表的质谱裂解图见图4，从图中可以看出其质谱裂解过程合理。
以上所述仅说明了本发明的几个实施方式，并不能因此而理解是对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的其他人员来说，在不脱离本发明的构思和范围的情况下，还可进行修改替换改进等，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的专利保护范围应以所描述的权利要求为准。
