基于非挥发物质采用核磁共振和偏最小二乘法鉴定特定品牌酱香白酒的方法
技术领域
本发明属于酱香白酒鉴别
技术领域
，具体涉及基于酱香白酒非挥发物质采用核磁共振氢 谱(1H NMR)技术结合偏最小二乘分析法，以鉴别未知酒样是否为特定品牌酱香白酒。背景技术
近年来酱香白酒(简称酱酒)的消费在全国都很火爆，“酱酒热”在全国范围内呈现燎 原之势，酱酒市场成为我国酱香白酒市场主赛道。假酒的生产工艺和工序是完全达不到正品 酱香白酒的标准的，其生产工艺不合格，生产出来的酱香白酒虽然只有在口感上略微差别， 但是对身体的危害性是难以估计的。同时，对于特定品牌酱酒来讲，市场上以假乱真的行为 将严重损害产品品牌形象，也影响酱酒的健康发展。
所以，建立一套科学有效的真假酒鉴别方法，对于规避风险降低企业及消费者的经济损 失，对于维护产品品牌形象，保障消费者的安全与权益，规范酱香型酱香白酒行业与市场稳 健发展具有重要意义。
目前酱香白酒鉴别的方法，有的单纯基于挥发性风味物质的方法有气相色谱法、电子鼻 等，也有兼顾挥发性及非挥发性物质的方法如光谱法、液相色谱法、质谱法、电子舌等方法， 还有基于酱香白酒稳定同位素比值的方法，以上述方法结合多元统计分析法研究最为前沿。
虽然酱香白酒中非挥发物质通常不呈现香气，但对味觉、口感、健康功能等有很大影响。 然而当前已有酱香白酒真伪鉴别方法存在以下不足：(1)无专门针对酱香白酒非挥发性物 质进行酱香白酒真伪鉴别的研究或应用。(2)已有酱香白酒非挥发性物质检测方法，均为 某类非挥发物质的靶向检测，无法实现非靶向的非挥发性物质的检测。(3)已有酱香白酒 非挥发性物质检测方法，通常需要进行衍生化处理，该步骤不仅有损样品造成鉴别结果存在 误差，而且实验过程操作繁琐。综上所述，目前还没有‘非靶向的基于酱香白酒非挥发性物 质的酱香白酒鉴别方法’。
因此，提供一种非靶向的检测酱香白酒中非挥发性成分的方法，对于酱香白酒真伪或未知酒 样是否为特定品牌酱香白酒的鉴别意义重大。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供基于酱香白酒非挥发物质采用核磁共振氢谱结合 偏最小二乘法鉴定未知酒样是否为特定品牌酱香白酒的方法。
本方案中的基于非挥发物质采用核磁共振和偏最小二乘法鉴定特定品牌酱香白酒的方 法，包括以下步骤：
步骤一、建立特定品牌酱香白酒数据集
A1、制备N个不同批次特定品牌酱香白酒样品，挥干酒样，然后加入磷酸缓冲盐溶液 溶解，磷酸缓冲盐溶液中含有3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠作为定标物质，离心后取上清液 转入核磁管中；
A2、1H NMR检测：核磁管中的样品进行1H NMR检测，检测数据由布鲁克装载超低 温探头的600M核磁检测记录，使用标准的一维复合脉冲序列对酒样进行分析，并在弛豫延 迟期间进行预饱和；循环延迟时间为2s，混合时间为1s，每个样品的90°脉冲宽度设置为 9.89μs，发射机频率偏移量为2820.78Hz，预饱和的功率级为23.00dB，数据点为64k，光 谱宽度为12019.230Hz，扫描次数为128次，得到特定品牌酱香白酒的核磁共振信号，建立 不同批次特定酱香白酒的非挥发性物质1H NMR谱图；
A3、谱图处理及导出测定结果：将采集的谱图导入到核磁软件MestReNova中，冲零至64K数据点，基线校正，积分范围为0.4～9.0之间，积分间隔为0.002ppm，总面积归一化处理，得到分段积分结果；
A4、以分段积分结果作为自变量X矩阵，以不同批次特定品牌酱香白酒作为因变量Y 矩阵，建立特定品牌酱香白酒数据集；
步骤二、建立其它品牌酱香白酒数据集
B1、制备M个其它品牌酱香白酒样品，挥干酒样，然后加入磷酸缓冲盐溶液溶解，磷酸缓冲盐溶液中含有3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠作为定标物质，离心后取上清液转入核磁管中；
B2、按照步骤A2～A4的方法，获得其它品牌酱香白酒数据集；
步骤三、构建鉴别模型
C1、将特定品牌酱香白酒数据集与其它品牌酱香白酒数据集合并得到的工作集导入 SIMCA软件，对工作集中的数据进行标准化，将工作集中的数据分成t组特定品牌酱香白酒 和f组其它品牌酱酒，然后选择建立PLS-DA模型，形成未拟合的PLS-DA模型；
C2、在所述SIMCA软件中对C1中未拟合的PLS-DA模型进行自动拟合，根据交叉有效性指标，选取对变量累计贡献率>99％的成分作为主成分建立偏最小二乘回归模型，得到最佳的PLS-DA模型；
步骤四、PLS-DA模型的评估及验证
通过PLS-DA模型中每一组份解释的变量Y所占的分数R2Y(cum)和根据交叉验证的模 型预测变量Y所占的分数Q2(cum)，评价模型的累计解释能力和交叉有效性；
对拟合好的模型通过排列实验验证其拟合程度，排列次数为200次，p<0.05；Q2在Y轴的截距<0.05，表示模型没有出现过拟合；相关系数0.9～1范围内，说明模型的预测值与实 际值间误差小；
步骤五、未知酒样的鉴别
将X个待鉴别的未知酒样按A1～A4的方法，得到预测集导入步骤三已建立的PLS-DA模型 进行预测，若预测结果同时满足处于PLS-DA模型中特定品牌酱香白酒所在的象限区域，且 与特定品牌酱香白酒吻合度大于0.7，接近1的条件，则未知酒样为特定品牌酱香白酒，否 则为非特定品牌酱酒。
本方案的有益技术效果是：
本申请根据酱香白酒非挥发性化合物对味觉、口感、健康功能等产生影响的特点，首次 利用基于酱香白酒非挥发物质的1H NMR检测技术结合偏最小二乘分析法，实现了鉴别未知 酒样是否为特定品牌酱香白酒的目的，相比于已有酱香白酒非挥发物质检测方法，该方法不 仅样品无需衍生化处理，可实现酱香型酱香白酒中非挥发物质的非靶向检测。重要的在于该 方法可实现‘基于代谢组学思路’的非靶向的酱香白酒非挥发物质检测，属该领域首次应用， 极具创新性，且在特定品牌酱香白酒的鉴别中应用效果极佳。
利用本方法对未知酒样进行鉴别，高度真实的判断出所检测的酒样是否为特定品牌酱香 白酒，最大程度规避风险降低特定品牌酒企业的经济损失。
进一步，A1中采用37℃恒温氮气流吹干酱香白酒样品。已有应用于酒类样品的核磁共 振氢谱技术，检测时采用溶剂峰压制的方式对乙醇峰和水峰进行压制，这种方式可解决微量 成分被掩盖或检测困难等问题，但该方式本身会相应的使酒中微量物质信号峰受到影响，进 而影响到检测结果的真实性；因此，就反映样品真实性而言，直接的方式是去除酒样中乙醇 和水，酱香白酒乙醇含量相对较高，不适用真空冷冻干燥，若采用先蒸发去除乙醇再冷冻干 燥的方式又过于繁琐、耗时。因此，本方案选取氮气吹干的方式对酱香白酒进行浓缩，氮吹 操作简单且可同时处理多个样品，能大大缩短检测时间；虽然浓缩会有损酱香白酒中的挥发 性物质，但是酱香白酒中的非挥发物质却不会受到样品浓缩的影响，是原酒样的真实反映。
进一步，步骤A1中酒样的用量为5mL，磷酸缓冲盐的pH值为3，用量为600uL。
进一步，步骤A1中离心是转速为14000rpm/min，时间为10min。
附图说明
图1为本发明基于非挥发物质采用核磁共振和偏最小二乘法鉴定特定品牌酱香白酒的流 程图；
图2为不同批次特定品牌酱香白酒1H NMR谱图的放大图；
图3为PLS-DA模型得分图；
图4为PLS-DA模型排列实验；
图5为未知酒样PLS-DA模型验证得分图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
1、仪器、试剂和样品
1.1仪器：核磁共振波谱仪(Bruker，600MHz)，SIMCA软件(Umetrics)、离心机(艾本德，德国)、核磁管
1.2试剂：磷酸(≥85％，aladdin)、磷酸二氢钠(≥99.0％，Macklin)、3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠(98％，Sigma-Aldrich)、重水(美国CIL)
1.3样品：共33个成品酱香型酱香白酒样本：包括7个特定品牌酱香白酒(编号为GB1～ GB7)，15个其它品牌酱香白酒(编号为QT1～QT15)，11个未知酒样(编号为YZ1～YZ11)， 11个未知酒样的设计规则是：有一个为特定品牌酱香白酒，其余均为其它品牌酱香白酒。
2.酒样前处理
精密吸取5mL酱香白酒样品，在37℃的恒温氮气流下吹干，加入600uL的磷酸缓冲盐(0.1M，PH＝3)进行溶解，磷酸缓冲盐溶液中含有3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠作为定标物质，14000rpm/min离心10min，取上清液备用；
3、建立特定品牌酱香白酒数据集
A1、所述的7个特定品牌酱酒的上清液，各取500uL转移到5mm的核磁管中进行检测；
A2、1H NMR检测：样品数据由布鲁克装载超低温探头的600M核磁检测记录，使用标准的一维复合脉冲序列(noesygppr1d)对样本进行分析，并在弛豫延迟期间进行预饱和；循环 延迟时间为2s，混合时间为1s，每个样品的90°脉冲宽度设置为9.89μs，发射机频率偏移量为2820.78Hz，预饱和的功率级为23.00dB，数据点为64k，光谱宽度为12019.230Hz， 扫描次数为128次，得到特定品牌酱香白酒的核磁共振信号，建立不同批次特定酱香白酒的 非挥发性物质1H NMR谱图，如图2所示；
A3、谱图处理及导出测定结果：将采集的谱图导入到MestReNova中，冲零至64K数据 点，基线校正，积分范围为0.4～9.0之间，积分间隔为0.002ppm，总面积归一化处理，得到 分段积分结果；
A4、以分段积分结果作为自变量X矩阵，以不同批次特定品牌酱香白酒作为因变量Y 矩阵，建立特定品牌酱香白酒数据集；
4、建立其它品牌酱香白酒数据集
B1、所述的15个其它品牌酱酒的上清液，各取500uL转移到5mm的核磁管中进行检测；
B2、按照步骤A2～A4的方法，获得其它品牌酱香白酒数据集；
5、构建鉴别模型
C1、将特定品牌酱香白酒数据集与其它品牌酱香白酒数据集合并得到的工作集导入 SIMCA软件，对工作集中的数据进行标准化，将工作集中的数据分成t组特定品牌酱香白酒 和f组其它品牌酱酒，然后选择建立PLS-DA模型，形成未拟合的PLS-DA模型；
C2、在所述SIMCA软件中对C1中未拟合的PLS-DA模型进行自动拟合，系统根据交叉有效性指标，选取对变量累计贡献率＞99％的成分作为主成分建立偏最小二乘回归模型， 得到最佳的PLS-DA模型，如图3所示，可见特定品牌酱香白酒在PLS-DA得分图上获得良好的区分，特定品牌酱香白酒集中在第三象限，其它酱酒集中在第一、二、四象限，聚类效果良好。
6、PLS-DA模型的评估及验证
通过PLS-DA模型中每一组份解释的变量Y所占的分数R2Y(cum)和根据交叉验证的模 型预测变量Y所占的分数Q2(cum)，评价模型的累计解释能力和交叉有效性，结果见表1；对拟合好的模型通过排列实验验证其拟合程度，排列次数为200次，p＜0.05，PLS-DA模型验证见图3、结果见表2。
Q2在Y轴的截距＜0.05，表示模型没有出现过拟合；相关系数越接近1，说明模型的预 测值与实际值间误差越小。
表1 PLS-DA模型参数信息
Component
R2X
R2X(cum)
Eigenvalue
R2Y
R2Y(cum)
Q2
Limit
Q2(cum)
Significance
Iterations
0
Cent.
1
0.135
0.135
2.97
0.689
0.689
0.386
0.05
0.386
R1
2
2
0.0924
0.227
2.03
0.259
0.948
0.447
0.05
0.661
R1
2
表2 PLS-DA模型排列实验结果列表
从表1、表2可知，拟合后的PLS-DA模型的相关系数R2Y(cum)为0.948，Q2(cum) 为0.661，表明该PLS-DA模型具有较好的解释能力和交叉有效性，样品真实性与解释变量 存在明显的线性关系，且模型验证如图4所示，Q2的回归线截距为-0.22，小于0.05，且所 有左边的Q2值均低于最右边的原始点，不存在过拟合现象，证明了模型的合理与准确性。
7、未知酒样的鉴别预测
将11个未知酒样按A1～A4的方法，组成的数据集导入已建立的PLS-DA模型进行预测， 预测结果见表3和图5。
从图5和表3可知，11个验证样品只有YZ7位于第三象限，与特定品牌酱香白酒的吻合程度为1.08，接近1.0，即在0.7～1.3的范围内。除YZ7外其它验证样品均位于第一、二、四象限，且与特定品牌酱香白酒的吻合度小于0.7。结果表明YZ7为特定品牌酱香白酒，其它酒样均为非特定品牌酱酒；总体表明11个未知酒样(1个特定品牌10个其它品牌)都得 到正确的分类，总体鉴别正确率为100％。
表3 未知酒样PLS-DA模型验证结果
样品编号
与特定品牌酱酒(t)吻合度
与其它品牌酱酒(f)吻合度
验证结果
YZ1
0.009169
0.990831
f
YZ2
0.244550
0.755450
f
YZ3
0.196000
0.804000
f
YZ4
-0.237833
1.237830
f
YZ5
-0.097571
1.097570
f
YZ6
-0.112115
1.112120
f
YZ7
1.082600
-0.082604
t
YZ8
0.098670
0.901330
f
YZ9
-0.073214
1.073210
f
YZ10
0.158764
0.841236
f
YZ11
0.099371
0.900629
f
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