一种人参皂苷Rg1分子印迹聚合材料的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种分子印迹聚合材料的制备方法及快速检测应用
技术领域
,尤其涉及一种人参皂苷Rg1分子印迹聚合材料的制备方法及其在检测药品、食品、生物样品中的人参皂苷Rg1的应用。背景技术
人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A. Mey的干燥根和根茎,是我国传统的名贵中药,最初记载于我国第一部本草类专著《神农本草经》,具有补气生血、扶正祛邪等功效。同时人参也是参苓白术散、开心散等许多经典名方中的主要药味,发挥着重要的防病治病作用。现代药理作用研究表明人参对人体的中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统、血液及造血系统、内分泌系统、生殖系统以及免疫系统等各个系统发挥作用。人参皂苷是人参中的主要活性成分,具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增强记忆力等多种作用。
人参皂苷类成分数量繁多,现已明确知道的人参皂苷单体约有50余种,在人参中的含量占4%左右。人参皂苷Rg1是人参皂苷中的一种主要活性成分,属于原人参三醇型皂苷,具有心血管保护、神经系统保护、抗衰老、抗炎、抗肿瘤等多种活性,是人参含量测定的主要指标成分之一。目前人参皂苷的含量测定主要采用高效液相色谱法,人参皂苷的众多成分结构相似,理化性质差别小,导致单体之间的色谱行为接近,因此在含量测定的过程中分离难度大,准确检测存在困难。更有甚者,人参皂苷含量低,中药复方其他药味的化学成分对人参皂苷的分离检测存在很大干扰,更加增大了准确测定人参皂苷含量的难度。
分子印迹聚合物(Molecular imprinting polymer, MIPs)是指以目标分子为模板,将具有结构互补的功能单体通过共价或非共价的方式与模板分子结合,加入交联剂进行聚合反应,反应完成后将模板分子洗脱形成的一类有固定空穴大小和形状及有确定排列功能团的高交联聚合物。因为制备的材料有着极高的选择性及卓越的分子识别性能,很快在固相萃取、人工酶学、手性拆分、生物感器、不对称催化等方面得到了广泛的应用。因此,建立一种制备人参皂苷Rg1的分子印迹聚合物的制备方法,利用制备的分子印迹聚合物应用于食品、药品、生物样品中的人参皂苷Rg1含量测定的前处理方法中,从而提高样品中人参皂苷Rg1的提取率和检测准确率,消除其他成分对其干扰和影响。
发明内容
本发明提供一种人参皂苷Rg1分子印迹聚合物的制备方法及其应用,主要是以人参皂苷Rg1为模板,分别加入功能单体和交联剂,热引发、沉淀聚合制备出对人参皂苷 Rg1具有特异选择性的人参皂苷Rg1分子印迹聚合物,提高人参皂苷Rg1的提取率和吸附率,而消除单味和复方中药中其他成分对其干扰及影响。
本发明一方面提供一种人参皂苷Rg1分子印迹聚合材料的制备方法,由以下步骤制得:
(1)将模板分子、功能单体混合溶解在致孔剂中,超声混匀,加入有效量的交联剂,快速搅拌形成混悬液,然后加入引发剂,通氮气至少30 min以除去溶解氧,密封;
(2)在氮气保护下,分子印迹聚合物采用热引发,置于带加热板磁力搅拌器中进行聚合反应;
(3)聚合反应结束后,所得到的分子印迹聚合物用甲醇、乙酸和水的混合液进行洗脱,对洗脱液进行高效液相检测,直至无模板物质检出为止,再用甲醇洗至中性,然后50℃真空干燥12~24h,得到人参皂苷Rg1分子印迹聚合物。
进一步地,步骤(1)中所述的功能单体为4-乙烯基苯硼酸,3-丙烯酰胺基苯硼酸、三氨基苯硼酸中一种。人参皂苷Rg1与功能单体的摩尔比为1:(4~15),优选为1:(10~15)。
进一步地,步骤(1)中所述的致孔剂为无水乙醇、无水甲醇、乙腈和异丙醇的一种。致孔剂的体积用量为5~15mL。
进一步地,步骤(1)中所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯,三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯,N,N-亚甲基二丙烯酰胺中的一种。交联剂的用量为0.3~0.9mmol。
进一步地,步骤(1)中所述的引发剂为偶氮二异丁腈和偶氮二异庚腈中一种,引发剂的用量为0.4~1.2mL(15mg/mL)。
进一步地,步骤(1)中所述的磁力搅拌器转速为400r/min~1500r/min,优选为1000r/min~1500r/min。
进一步地,步骤(1)中所述的聚合温度为40~60℃。
进一步地,步骤(1)中进一步地,所述的聚合反应时间为3~24h,优选为12~24h。
进一步地,步骤(1)中所述的洗脱方式为超声、磁力搅拌和恒温摇床振荡,优选为恒温摇床振荡。
进一步地,步骤(1)中所述洗脱液为酸性的甲醇或乙醇水溶液,采用甲酸或乙酸进行酸性调节,其洗脱溶液的体积比为甲醇或乙醇(43~92):甲酸或乙酸(8-12):水(0~45),优选地,甲醇-乙酸-水的体积比为60~65:8~10:25~32。
一种人参皂苷Rg1分子分子印迹聚合物,其特征在于,采用权利要求1-12所述制备方法制备得到的分子印迹聚合材料用于吸附分离人参皂苷Rg1的应用。其特征在于,所述人参皂苷溶液是由经人参皂苷Rg1标准曲线计算得出的质量百分含量为90.0%的人参皂苷Rg1和体积百分含量为30%~50%的乙醇水溶液混合制得;所述恒温振荡的温度为20℃~40℃,转速为150rpm~200rpm,振荡时间为2h~24h。
本发明还提供了上述分子印迹聚合材料在分离富集中药复方开心散及单味中药人参中人参皂苷Rg1的应用,包括以下步骤:将上述分子印迹聚合物作为固相萃取吸附剂,然后用中药复方开心散的提取液上柱,再用30%甲醇溶液淋洗,最后用70%甲醇溶液洗脱,流出液为人参皂苷Rg1。
本发明的优点和效果:本发明根据人参皂苷Rg1含有多个糖基的特点,优选功能单体,构建基于硼酸基的人参皂苷Rg1可逆共价分子印迹聚合物。该聚合物克服了传统非共价印迹聚合物受限于溶剂的影响,其制备和识别均可在强极性溶剂中如醇或水中进行。本发明采用恒温摇床振荡洗脱模板分子,与研究报道的索氏提取、超声洗脱和磁力搅拌等洗脱方式相比,恒温摇床振荡洗脱效果更好,仅振荡洗脱2 h,模板分子的洗脱率高达70.58%。
附图说明
图1、摘要用图,人参皂苷Rg1印迹聚合材料的制备原理图。
图2、实施例1制备的人参皂苷Rg1印迹聚合材料的傅里叶红外光谱图。
图3、实施例1制备的人参皂苷Rg1印迹聚合材料的扫描电子显微镜图。
图4、实施例1中分子印迹聚合材料(MIPs)和非印迹聚合材料(NIPs)对人参皂苷Rg1的吸附动力学曲线图。
图5、实施例1中分子印迹聚合材料(MIPs)和非印迹聚合材料(NIPs)对人参皂苷Rg1的吸附等温线图。
图6、实施例1中分子印迹聚合材料(MIPs)和非印迹聚合材料(NIPs)对人参皂苷Rg1、Re、Rb1、芦丁和槲皮素的选择性吸附效果对比图。
具体实施方式
所用化学试剂:4-乙烯基苯硼酸(4-VPBA)、3-丙烯酰胺基苯硼酸、三氨基苯硼酸(APBA);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、二乙基苯(DVB)、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)、N,N-亚甲基二丙烯酰胺(MBAA);偶氮二异丁腈(AIBN)、偶氮二异庚腈(ABVN)。:无水乙醇、无水甲醇和异丙醇。
实施例1
(1)将45.75 mg(0.05 mmol)模板分子人参皂苷Rg1、75.53 mg(0.5 mmol)功能单体4-VPBA加入到10 mL无水乙醇中,超声使溶解;加入132 μL(0.7 mmol)交联剂EGDMA,高速搅拌形成混悬液;加入0.8 mL引发剂AIBN(15 mg/mL)后,氮气吹扫至少30 min,以完全去除溶解氧,密封;
(2)在氮气保护下,分子印迹聚合物采用热引发,置于带加热板磁力搅拌器中进行聚合反应:60 ℃,1500 r/min,聚合反应12 h。
(3)聚合反应结束后,抽滤,所得聚合物置于真空干燥箱中60 ℃干燥12 h。接着聚合物以甲醇-乙酸-水(63:10:27,V/V)为洗脱溶剂,置于恒温培养振荡器中,振摇洗脱模板分子,直到洗脱液经高效液相检测不到模板分子为止,然后用甲醇洗至中性,干燥,即得MIPs。收率为85%。
(4)除合成过程中不添加模板分子人参皂苷Rg1以外,其余步骤均与印迹聚合物制备步骤相同,得到非印迹聚合材料(NIPs)。
(5)制备的分子印迹聚合物进行性状表征。图2为聚合得到的未脱模板的人参皂苷Rg1分子印迹聚合物的傅里叶红外光谱图,红外谱图解析:3483cm-1为模板分子Rg1的缔合-OH伸缩振动吸收峰,1604cm-1、1556cm-1、1455cm-1为功能单体4-VPBA苯环骨架的伸缩振动吸收峰;1728cm-1为交联剂EGDMA酯基C=O的伸缩振动。红外谱图分析可知聚合过程中模板分子人参皂苷Rg1、功能单体4-VPBA和交联剂EGDMA均成功交联聚合在聚合物上。图3为本实施例制备的人参皂苷Rg1的分子印迹聚合材料的扫描电子显微镜图,由图可知,聚合物微球粒径均一、单分散性较好。
实施例2
一种本发明的人参皂苷Rg1印迹聚合材料在吸附分离人参皂苷Rg1中的应用:
(1)不同振荡吸附时间条件下对人参皂苷Rg1的吸附容量,包括以下步骤:精密称取实施例1中MIPs和NIPs各5 mg于15 mL离心管中,分别加入1 mL 0.5 mg/mL的人参皂苷Rg1乙醇溶液,置于恒温培养振荡器中,20 ℃振荡吸附,分别于2、4、6、8、12、18和24 h离心取上清液,高效液相检测分析吸附溶液中Rg1的浓度变化,按照吸附前后的质量浓度差计算聚合物对Rg1的吸附量Q (μg/mg)随时间的变化情况。
(2)测定结果见图4本实施例中分子印迹聚合材料(MIPs)和非印迹聚合材料(NIPs)对人参皂苷Rg1的吸附动力学曲线图。由图可知,MIPs和NIPs随着时间的延长吸附量均逐渐增加,在12 h二者均达到吸附平衡。吸附平衡时MIPs的吸附量为31.90 μg/mg,NIPs的吸附量为14.58 μg/mg,MIPs的平衡吸附量是NIPs的2.2倍,说明MIPs印迹效果明显。
实施例3 底物浓度对人参皂苷Rg1印迹聚合材料吸附能力的影响
精密称取若干份实施例1中MIPs和NIPs各5 mg于15 mL离心管中,依次加入1 mL0.5 mg/mL、1 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL和2.5 mg/mL的人参皂苷Rg1乙醇溶液,置于恒温培养振荡器中,20℃振荡吸附12h,离心取上清液,依据中国药典2020版人参项下高效液相检测分析吸附溶液中Rg1的浓度变化,按照吸附前后的质量浓度差计算聚合物对Rg1的吸附量Q (μg/mg)。测定结果见图5本实施例中分子印迹聚合材料(MIPs)和非印迹聚合材料(NIPs)对人参皂苷Rg1的吸附等温线图。由图可知,在一定浓度范围内,随着吸附液中人参皂苷Rg1浓度的增大,MIPs和NIPs对Rg1的吸附量也逐渐增加。当吸附液中Rg1初始浓度升高到2.0 mg/mL时,MIPs和NIPs均达到吸附饱和,二者的饱和吸附量分别为62.22 μg/mg和29.70 μg/mg,MIPs的最大饱和吸附量是NIPs的2.1倍,表明MIPs对人参皂苷Rg1的吸附是一种有特异性识别位点的选择性吸附,不同于NIPs的纯物理吸附。这种特异性分子识别作用有赖于MIPs印迹孔穴的几何选择性和功能单体与模板分子之间的可逆共价键双重作用。
实施例4人参皂苷Rg1分子印迹聚合材料对人参皂苷Rg1的吸附选择性
(1)精密称取若干份实施例1中MIPs和NIPs各5 mg,分2组。第一组MIPs和NIPs分别加入1 mL 2.0 mg/mL的人参皂苷Rg1、Re、Rb1、芦丁和槲皮素的乙醇混合溶液;第二组MIPs和NIPs分别加入1 mL不同浓度的底物溶液(人参皂苷Rg1 0.5 mg/mL、Re 1.5 mg/mL、Rb1 2.0mg/mL、芦丁2.5 mg/mL、槲皮素2.5 mg/mL)。置于恒温培养振荡器中,20 ℃振荡吸附12 h,离心取上清液,高效液相检测分析各吸附溶液的浓度变化。以吸附量Q (μg/mg)评价MIPs的特异性吸附能力。测定结果见图6本实施例中分子印迹聚合材料(MIPs)和非印迹聚合材料(NIPs)对人参皂苷Rg1、Re、Rb1、芦丁和槲皮素的选择性吸附效果对比图。由A图可知,同一浓度水平下,MIPs对其模板分子人参皂苷Rg1具有优先选择性,对其结构类似物Re和Rb1的选择性明显低于模板分子。这是由于MIPs中具有与Rg1相匹配的特异性结合位点,能够选择性吸附模板分子Rg1;而人参皂苷Re和Rb1分子结构中含有与人参皂苷Rg1同样的母核,只是结构中含有的糖基数量和连接位置不同,导致它们在MIPs的分子识别与再吸附过程中无法完美进入印迹孔穴,因此在同一浓度水平下,MIPs对它们的吸附比模板分子低。此外,MIPs对黄酮类化合物芦丁也有一定的吸附,这是因为芦丁分子结构中含有2个糖基,但它的母核结构与人参皂苷Rg1相差太大,使得MIPs对其吸附量低于人参皂苷;MIPs对黄酮类化合物槲皮素无选择性。因为槲皮素不含糖基,其结构中不存在顺式二醇结构,导致MIPs无法结合槲皮素,而且其对槲皮素的吸附量小于NIPs。而NIPs只是单纯的物理吸附,因而对人参皂苷Rg1、Re、Rb1、芦丁和槲皮素的吸附量差别不大。以上结果表明,模板分子人参皂苷Rg1结构中的糖单元与功能单体4-VPBA产生了共价作用,并最终在聚合物的孔穴中产生了识别位点。由图B可知,MIPs对模板分子及其结构类似物均有吸附选择性,且与浓度相关。在一定范围内,底物浓度越高,吸附量越高。对不含糖基的槲皮素升高浓度依然没有吸附选择性。
实施例5 一种本发明的人参皂苷Rg1印迹聚合材料在分离富集中药复方开心散中人参皂苷Rg1及其结构类似物Re和Rb1的应用:
(1)开心散提取液的制备:精密称取2.5 g开心散粉末于锥形瓶中,加入70%甲醇25mL,称定重量,超声提取0.5 h,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液于蒸发皿中蒸干,残渣加水溶解,定容至5 mL量瓶,摇匀,即得。
(2)分子印迹固相萃取柱(MIP-SPE)的制备:称取实施例1中MIPs和NIPs各约25mg,分别装入空的SPE小柱,上下两端各用筛板固定。依次用1 mL甲醇、1 mL 50%甲醇和2 mL超纯水对MIP-SPE小柱进行活化,备用。
(3)MIP-SPE联用分离纯化开心散提取液中的皂苷类成分:将400 μL开心散提取液以一定流速缓慢通过MIP-SPE小柱进行加样,然后用30%甲醇分批(1 mL×3)淋洗柱子,消除非选择性吸附,收集淋洗液。最后用8 mL 70%甲醇-冰乙酸(9:1,V/V)溶液分批洗脱(1 mL×8)目标物,收集洗脱液,于蒸发皿中蒸干,甲醇复溶并定容于5 mL量瓶中。取开心散提取液、上样流出液、淋洗液和洗脱液,分别进行高效液相分析。测定结果见下表1。
]表1:MIP-SPE法从开心散中提取分离人参皂苷Rg1、Re和Rb1(n=3)
由表1可得,25 mg的MIPs分别吸附人参皂苷Rg1、Re和Rb1 59.25、457.12、907.33 μg,分别占上样液中人参皂苷Rg1、Re和Rb1总量的58%、61%和62%。最后用洗脱剂70%甲醇-冰乙酸(9:1,V/V)溶液分批洗脱,84%~90%的目标成分被洗脱下来。经NIPs上样吸附后,流出液中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的峰面积几乎不变,且30%甲醇淋洗液中出现大量目标成分,计算得目标成分的回收率只有7%~12%。表明NIPs中没有特异性结合位点,只是纯物理吸附。说明合成的MIPs对其模板分子人参皂苷Rg1及其结构类似物人参皂苷Re和Rb1具有较高的亲和力和选择性,MIP-SPE是一种提取复杂基质样品中人参皂苷的有效方法。
实施例6 一种本发明的人参皂苷Rg1分子印迹聚合材料的制备方法:
(1)将45.75 mg(0.05 mmol)模板分子人参皂苷Rg1、113.29 mg(0.75 mmol)功能单体4-VPBA加入到15 mL无水甲醇中,超声使溶解;加入170 μL(0.9mmol)交联剂EGDMA,高速搅拌形成混悬液;加入1.2 mL引发剂AIBN(15 mg/mL)后,氮气吹扫至少30 min,以完全去除溶解氧,密封;
(2)在氮气保护下,分子印迹聚合物采用热引发,置于带加热板磁力搅拌器中进行聚合反应:50 ℃,1000 r/min,聚合反应24h。
(3)聚合反应结束后,抽滤,所得聚合物置于真空干燥箱中40 ℃干燥24 h。接着聚合物以乙醇-甲酸-水(65:10:25,V/V)为洗脱溶剂,置于恒温培养振荡器中,振摇洗脱模板分子,直到洗脱液经高效液相检测不到模板分子为止,然后用甲醇洗至中性,干燥,即得MIPs。收率为75%。
实施例7 一种本发明的人参皂苷Rg1分子印迹聚合材料的制备方法:
(1)将45.75 mg(0.05 mmol)模板分子人参皂苷Rg1、90.64 mg(0.6 mmol)功能单体4-VPBA加入到10 mL无水乙醇中,超声使溶解;加入132 μL(0.7 mmol)交联剂EGDMA,高速搅拌形成混悬液;加入0.8 mL引发剂AIBN(15 mg/mL)后,氮气吹扫至少30 min,以完全去除溶解氧,密封;
(2)在氮气保护下,分子印迹聚合物采用热引发,置于带加热板磁力搅拌器中进行聚合反应:60 ℃,1500 r/min,聚合反应12 h。
(3)聚合反应结束后,抽滤,所得聚合物置于真空干燥箱中60 ℃干燥12 h。接着聚合物以甲醇-乙酸-水(63:10:27,V/V)为洗脱溶剂,置于恒温培养振荡器中,振摇洗脱模板分子,直到洗脱液经高效液相检测不到模板分子为止,然后用甲醇洗至中性,干燥,即得MIPs。收率为78%。
实施例8一种本发明的人参皂苷Rg1分子印迹聚合材料的制备方法:
(1)将45.75 mg(0.05 mmol)模板分子人参皂苷Rg1、38.198 mg(0.2 mmol)功能单体3-丙烯酰胺基苯硼酸加入到5mL乙腈中,超声使溶解;加入56 μL(0.3mmol)交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯,高速搅拌形成混悬液;加入0.4mL引发剂偶氮二异庚腈(15 mg/mL)后,氮气吹扫至少30 min,以完全去除溶解氧,密封;
(2)在氮气保护下,分子印迹聚合物采用热引发,置于带加热板磁力搅拌器中进行聚合反应:40 ℃,400 r/min,聚合反应24h。
(3)聚合反应结束后,抽滤,所得聚合物置于真空干燥箱中60 ℃干燥10 h。接着聚合物以甲醇-甲酸-水(43:12:45,V/V)为洗脱溶剂,置于恒温培养振荡器中,振摇洗脱模板分子,直到洗脱液经高效液相检测不到模板分子为止,然后用甲醇洗至中性,干燥,即得MIPs。收率为45%。
]实施例9一种本发明的人参皂苷Rg1分子印迹聚合材料的制备方法:
(1)将45.75 mg(0.05 mmol)模板分子人参皂苷Rg1、102.71 mg(0.75 mmol)功能单体三氨基苯硼酸加入到15mL异丙醇中,超声使溶解;加入114μL(0.6mmol)交联剂N,N-亚甲基二丙烯酰胺,高速搅拌形成混悬液;加入1.0mL引发剂偶氮二异庚腈(15 mg/mL)后,氮气吹扫至少30 min,以完全去除溶解氧,密封;
(2)在氮气保护下,分子印迹聚合物采用热引发,置于带加热板磁力搅拌器中进行聚合反应:50 ℃,1000 r/min,聚合反应16h。
(3)聚合反应结束后,抽滤,所得聚合物置于真空干燥箱中50 ℃干燥24 h。接着聚合物以甲醇-乙酸-水(60:8:32,V/V)为洗脱溶剂,置于恒温培养振荡器中,振摇洗脱模板分子,直到洗脱液经高效液相检测不到模板分子为止,然后用甲醇洗至中性,干燥,即得MIPs。收率为58.5%。
]实施例10一种本发明的人参皂苷Rg1分子印迹聚合材料的制备方法:
(1)]将45.75 mg(0.05 mmol)模板分子人参皂苷Rg1、113.30 mg(0.75 mmol)功能单体4-VPBA加入到10 mL无水乙醇中,超声使溶解;加入132 μL(0.7 mmol)交联剂EGDMA,高速搅拌形成混悬液;加入0.8 mL引发剂AIBN(15 mg/mL)后,氮气吹扫至少30 min,以完全去除溶解氧,密封;
(2)在氮气保护下,分子印迹聚合物采用热引发,置于带加热板磁力搅拌器中进行聚合反应:60 ℃,1500 r/min,聚合反应12 h。
(3)聚合反应结束后,抽滤,所得聚合物置于真空干燥箱中60 ℃干燥12 h。接着聚合物以甲醇-乙酸-水(63:10:27,V/V)为洗脱溶剂,置于恒温培养振荡器中,振摇洗脱模板分子,直到洗脱液经高效液相检测不到模板分子为止,然后用甲醇洗至中性,干燥,即得MIPs。收率为69.3%。
实施例11 一种本发明的人参皂苷Rg1分子印迹聚合材料的制备方法
(1)将45.75 mg(0.05 mmol)模板分子人参皂苷Rg1、75.53 mg(0.5 mmol)功能单体4-VPBA加入到10 mL无水乙醇中,超声使溶解;加入132 μL(0.7 mmol)交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯,高速搅拌形成混悬液;加入0.8 mL引发剂偶氮二异庚腈(15 mg/mL)后,氮气吹扫至少30 min,以完全去除溶解氧,密封;
(2)在氮气保护下,分子印迹聚合物采用热引发,置于带加热板磁力搅拌器中进行聚合反应:60 ℃,1500 r/min,聚合反应24 h。
(3)聚合反应结束后,抽滤,所得聚合物置于真空干燥箱中60 ℃干燥12 h。接着聚合物以甲醇-乙酸-水(63:10:27,V/V)为洗脱溶剂,置于恒温培养振荡器中,振摇洗脱模板分子,直到洗脱液经高效液相检测不到模板分子为止,然后用甲醇洗至中性,干燥,即得MIPs。收率为73%
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本领域的技术人员,在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下,都可以利用上述方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动或修改为等同变化的等效实施例。因此,凡是未脱离本发明技术方案的内容,以及本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化,均仍属于本发明技术防范保护的范围。