一种多肽及其应用
技术领域
本发明涉及多肽领域，具体涉及一种新型多肽的序列设计以及该多肽在皮肤抗皱领域的用途。
背景技术
皮肤是位于人体最外层的保护屏障。随着人类年龄的不断增加，皮肤会逐渐呈现出衰老的现象。这种现象的产生存在多种内在及外在诱因，内在诱因主要是由于人体自身的再生能力随着年龄的增加逐渐减弱；外在诱因则包括紫外线及电磁辐射、长期熬夜等。这些内、外诱因的叠加作用会导致面部皮肤表现出皱纹加深加多、皮肤松弛、胶原蛋白大量流失等特征。
上世纪90年代，国外研究人员发现原本具有治疗肌肉痉挛、斜视等疾病的A型肉毒毒素具有良好的去皱效果，因此也开始将其应用于整形及美容领域。肉毒毒素是由肉毒杆菌在繁殖过程中所产生的一种神经毒素蛋白，大小为150kD的多肽，它的作用方式为抑制周围运动神经末梢突触前膜乙酰胆碱的释放，从而导致肌肉松弛性麻痹，抑制肌肉的收缩。但是肉毒毒素在作为去皱产品应用时也面临诸多问题。首先，肉毒毒素需要通注射发挥作用且注射一次后维持效果时间有限；其次，肉毒毒素价格昂贵，受众面相对较小；最重要的是，有些机构操作及使用不当会引起使用者留下面部僵硬、面瘫等后遗症。因此，科学家们开始寻找肉毒素的功效替代物。
近年来，随着对肉毒毒素结构及功能研究的不断深入，科学家尝试设计并合成了一类具有显著类肉毒作用的成分-神经肌肉松弛类多肽。这些多肽的安全性优于肉毒毒素，主要是通过两种方式发挥抗皱作用，第一类是通过抑制神经末梢突触前膜乙酰胆碱的释放，阻断神经传递肌肉收缩讯息；第二类是通过抑制乙酰胆碱与及细胞膜上受体结合，阻止肌肉收缩。目前，科学家们已经开发并应用于护肤品中的小分子多肽主要包括乙酰基六肽-8（阿基瑞林）、乙酰基八肽-3及二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐等，这类多肽均通过添加在护肤品中涂抹使用。
乙酰基六肽-8在美容领域应用最广泛，它是一种由6个氨基酸脱水缩合组成的生物活性多肽，合成方法主要包括固相合成法及液相合成法，然而该多肽的抗皱效果不是很明显，造成效果不明显的主要原因是由于其与操控释放乙酰胆碱的特异性受体SNARE蛋白质组合体的结合力差，且乙酰基六肽-8属于亲水性多肽，很难穿过表皮层进入真皮层发挥作用。乙酰基八肽-3属于乙酰基六肽-8的延长肽，与六肽相比，乙酰八肽-3和特异性受体的结合率有所提升，但是随着肽链长度的增加，多肽的透皮性会降低。二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐是一种模拟蛇毒血清的合成三肽，是通过阻止乙酰胆碱的神经传导发挥抗皱作用。
随着人们生活及经济水平的提高，越来越多的人开始关注肌肤护理，高度重视抗衰抗皱。近些年来，多种活性多肽被报道已经添加到不同的护肤品中，含有多肽的护肤品可以缓解肌肤出现的干纹细纹、粗糙以及色斑等多种肌肤问题。除此之外，多种多肽原液也层出不穷。目前市面上常见的多肽有六肽、五肽、三肽和八肽等，根据不同多肽的性质可适用于脸部、内眼角、前额等不同部位。
然而，目前市面上现有的多肽产品在技术上仍存在一些问题。首先，市面上现有的多肽产品存在与皮肤亲和力不足的问题，一般情况下，对于多肽产品来说，肽链越长越难以穿透皮肤屏障，因此，市面上现有的多肽产品会通过减少肽链长度来提高其穿透性，这同时会舍弃不少肽链上发挥功效的部位，造成多肽功效性降低。本发明所描述的经过改造修饰后的十五肽同时兼顾了穿透性和功效性，具有创新性；另外，市面上现有的多肽产品稳定性较差，多肽由于其特殊的分子结构，容易被蛋白酶识别和水解。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术存在的问题，提供一种多肽及其应用，本发明提供的多肽通过特殊技术手段对多肽结构进行了一定程度的修饰和改造，提高了肽链结构的稳定性，从而能更长时间地发挥功效。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，提供具有通式（Ⅰ）结构的多肽：
Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-Ala（Ⅰ）
以及它的衍生物、异构体、混合物、化妆品或药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物；
其中，R选自Ser、Glu、Phe、Met、Arg、Asn、Gln和Leu中的至少一种。
优选地，所述多肽的氨基酸序列为：Asn-Glu-Leu-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-Ala，缩写为：NELEEMQRRA，分子量：1275.38。
优选地，所述多肽的氨基酸序列为：Arg-Asn-Glu-Leu-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-Ala，缩写为：RNELEEMQRRA，分子量：1431.57。
优选地，所述多肽的氨基酸序列为：Met-Arg-Asn-Glu-Leu-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-Ala，缩写为：MRNELEEMQRRA，分子量：1562.77。
优选地，所述多肽的氨基酸序列为：Phe-Met-Arg-Asn-Glu-Leu-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-Ala，缩写为：FMRNELEEMQRRA，分子量：1709.94。
优选地，所述多肽的氨基酸序列为：Glu-Phe-Met-Arg-Asn-Glu-Leu-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-Ala，缩写为：EFMRNELEEMQRRA，分子量：1839.05。
优选地，所述多肽的氨基酸序列为：Ser-Glu-Phe-Met-Arg-Asn-Glu-Leu-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-Ala，缩写为：SEFMRNELEEMQRRA，分子量：1926.13。
优选地，所述多肽包括氨基端保护基、羧基端保护基中的一种或多种。
优选地，所述氨基端保护基选自任选取代的C2-10酰基或任选取代的C2-10酰胺基。
优选地，所述氨基端保护基选自乙酰基或乙酰胺基。
优选地，所述羧基端保护基选自任选取代的C2-10酰基。
优选地，所述羧基端保护基选自乙酰基。
第二方面，提供所述的多肽在作为肌肉麻痹松弛剂中的应用。
第三方面，提供所述的多肽在作为皮肤抗皱剂中的应用。
本发明所述的氨基酸序列采用标准 Fmoc方案，通过树脂的筛选，合理的多肽合成方法。将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。
术语解释：
Ser表示英文名称为Serine，中文名称为丝氨酸的相应残基；
Glu表示英文名称为Glutamic，中文名称为谷氨酸的相应残基；
Phe表示英文名称为phenylalanine，中文名称为苯丙氨酸的相应残基；
Met表示英文名称为Methionine，中文名称为蛋（甲流）氨酸的相应残基；
Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的相应残基；
Asn表示英文名称为Asparagine，中文名称为天冬酰胺的相应残基；
Leu表示英文名称为Leucine，中文名称为亮氨酸的相应残基；
Ala表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的相应残基；
Gln表示英文名称为Glutamine，中文名称为谷氨酰胺的相应残基。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
现有日化产品使用的短肽多为10肽以下，其稳定性、亲和力、渗透皮肤屏障不理想。A型肉毒素受到剂量和作用可逆等限制，且长期注射可能会造成长期、严重的不良反应，如呼吸困难、肌肉无力、肉样瘤肉芽肿、头痛、流感样症状、过敏反应等。本发明制备的仿A型肉毒素的十五肽，稳定性、渗透性和亲和力好，且展现出良好的生物相容性，用于面部表情肌麻痹松弛，已达到改善面部轮廓和消除或减少褶皱的功效。
附图说明
图1为短肽处理小鼠3小时对后肢形态拍照结果图；
图2为为短肽处理小鼠后1、2、3和4小时对后肢形态拍照结果图；
图3为短肽处理小鼠1、2、3和4小时利用小鼠抓力测定仪的小鼠的抓力结果图；
图4为短肽处理小鼠1、2、3和4小时利用小鼠疲劳仪测定小鼠的耐力变化结果图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明进行进一步举例说明。
实施例1：
本实施例提供一种多肽，所述多肽的氨基酸序列为：Asn-Glu-Leu-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-Ala，缩写为：NELEEMQRRA，分子量：1275.38。
本实施例的多肽由以下方法制备而成：
本发明所述的氨基酸序列采用标准 Fmoc 方案，通过树脂的筛选，合理的多肽合成方法。将目标多肽的 C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。
首先将一个用Fmoc基团对α-氨基进行保护的氨基酸通过一个支臂连结到一个不溶性载体上，最后将α-氨基脱保护，用溶液洗涤氨基酸-支臂-树脂，将第二个预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦连反应连接上去。此外，也可以用α-N端及侧链保护的肽片段代替单个的氨基酸进行耦联反应，缩合反应完成后，用溶液洗涤，重复进行脱保护、耦联，直到得到目的肽，最后将肽-支臂-树脂裂解，这种延长肽链的固相合成法既可以采用间断的方法，也可使用连续流动的方法。
（1）C末端氨基酸与树脂结合；
（2）Na-Fmoc的脱除、洗涤；
（3）耦联、洗涤；
（4）重复步骤（2）~步骤（3）；
（5）脱保护基。
实施例2：
本实施例提供一种多肽，所述多肽的氨基酸序列为：Arg-Asn-Glu-Leu-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-Ala，缩写为：RNELEEMQRRA，分子量：1431.57。
实施例3：
本实施例提供一种多肽，所述多肽的氨基酸序列为：Met-Arg-Asn-Glu-Leu-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-Ala，缩写为：MRNELEEMQRRA，分子量：1562.77。
实施例4：
本实施例提供一种多肽，所述多肽的氨基酸序列为：Phe-Met-Arg-Asn-Glu-Leu-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-Ala，缩写为：FMRNELEEMQRRA，分子量：1709.94。
实施例5：
本实施例提供一种多肽，所述多肽的氨基酸序列为：Glu-Phe-Met-Arg-Asn-Glu-Leu-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-Ala，缩写为：EFMRNELEEMQRRA，分子量：1839.05。
实施例6：
本实施例提供一种多肽，所述多肽的氨基酸序列为：Ser-Glu-Phe-Met-Arg-Asn-Glu-Leu-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-Ala，缩写为：SEFMRNELEEMQRRA，分子量：1926.13。
实施例7：
本实施例与实施例1-6的区别在于，本实施例在实施例1-6任一项的多肽序列上增加了氨基端保护基；
本实施例所述氨基端保护基选自乙酰基或乙酰胺基；
在一些实施例中，所述氨基端保护基选自丙酰基或丙酰胺基；
在一些实施例中，所述氨基端保护基选自丁酰基或丁酰胺基；
在一些实施例中，所述氨基端保护基选自异丁酰基或异丁酰胺基。
在一些实施例中，所述氨基端保护基选自仲丁酰基或仲丁酰胺基。
在一些实施例中，所述氨基端保护基选自叔丁酰基或叔丁酰胺基。
在一些实施例中，所述氨基端保护基选自戊酰基或戊酰胺基。
实施例8：
本实施例与实施例1-6的区别在于，本实施例在实施例1-6任一项的多肽序列上增加了羧基端保护基
本实施例所述羧基端保护基选自乙酰基；
在一些实施例中，所述羧基端保护基选自丙酰基或丙酰胺基；
在一些实施例中，所述羧基端保护基选自丁酰基或丁酰胺基；
在一些实施例中，所述羧基端保护基选自叔丁酰基或叔丁酰胺基。
除非特别说明，本实施例1-8的多肽由已知的FMOC固相合成法合成而成。
FMOC固相合成法合成原理如下：
将目标多肽的 C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。
实施例9：
本实施例提供所述的多肽在作为肌肉麻痹松弛剂中的应用。
一.实验方案：
使用实施例6所述的十五肽用于小鼠腓肠肌麻痹松弛实验研究：
小鼠使用8-12周龄的C57品系小鼠；
小鼠腓肠肌注射实验设计分为NaCl组（正常组），六肽组（对照组）和十五肽组（处理组），每组不少于3只；
十五肽用于小鼠腓肠肌麻痹松弛的对照组为仿A型肉毒素的六肽；
十五肽用于小鼠腓肠肌麻痹松弛的使用剂量筛选：
注射方式采用微量注射器，后肢小腿腓肠肌肌肉注射；
给药方式采用单次注射，四肢给药；
给药剂量分别为 10μg、20μg和30μg三组；
注射后3h通过观察小鼠后肢脚趾形态及松弛程度，确定最佳使用剂量；
十五肽用于小鼠腓肠肌麻痹松弛的效果评估：
给药剂量：六肽组剂量与述筛选最佳的十五肽组的剂量相同；
注射方式按照上述方案分别对不同组别的小鼠腓肠肌注射；
注射后分别于1h、2h、3h和4h采用小鼠疲劳仪和小鼠抓力测定仪评估六肽和十五肽对小鼠腓肠肌麻痹松弛的效果。
二、实验结果：
1. 十五肽用于小鼠腓肠肌麻痹松弛的剂量筛选
通过观察六肽和十五肽注射不同剂量组小鼠后肢形态，发现在注射后3小鼠，六肽和十五肽在20ug剂量组小鼠后肢出现的肌肉无力松弛最明显，表现为小鼠脚趾蜷缩及松弛无力，且十五肽组效果优于六肽组（见图1）。图1中6代表仿A型肉毒素六肽；15代表仿A型肉毒素十五肽。
2. 十五肽用于小鼠腓肠肌麻痹松弛的效果评估
六肽和十五肽都采用20ug注射剂量进行单次，四肢肌肉注射。分别于注射后1、2、3和4小时对小鼠后肢形态观察和抓力及耐力测定。
通过观察六肽和十五肽注射不同时间点小鼠后肢形态，发现较正常组六肽组和十五肽组小鼠后肢在2小时时开始小鼠脚趾出现并拢情况，到3小时十五肽组较六肽组出现明显蜷缩和肌无力现在，至4小时该现象是仍然存在（见图2）。图2中6代表仿A型肉毒素六肽；15代表仿A型肉毒素十五肽。
通过对六肽和十五肽注射不同时间点小鼠抓力测定，实验结果显示注射后2小时内各组间小鼠的抓力无显著差异，3至4小时六肽和十五肽较正常组相比小鼠抓力明显下降，且十五肽组小鼠的抓力下降更为显著（见图3）。图3中6代表仿A型肉毒素六肽；15代表仿A型肉毒素十五肽。
通过对六肽和十五肽注射不同时间点小鼠耐力测定，测试结果显示注射后2小时，六肽和十五肽组小鼠较正常组小鼠出现跑动时间和跑动距离减少，提示小鼠耐力开始下降；在3小时两组小鼠耐力下降最为显著，且十五肽组效果优于六肽组（见图4）。图4中6代表仿A型肉毒素六肽；15代表仿A型肉毒素十五肽。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
