具体实施方式

实施例1(化合物的制备)

本例中所述甾体衍生物由以下步骤组成：

步骤一：

将2.1g氢氧化钠溶解于18mL水，冰浴滴加2.88g溴素，当溴完全溶解，将混合物加入12mL二氧六环得混合液；取该混合液加入含1.44g孕烯醇酮醋酸酯(1)的溶液(56mL二氧六环和16mL水的混合溶液)，搅拌过夜后加入亚硫酸钠，加热回流直到固体完全溶解，加盐酸酸化后析出白色固体，固体水洗至溶液无色。

上述步骤一的化学反应式如下：

将所得到的白色固体采用核磁共振谱进行鉴定，鉴定结果为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.88(s,1H),5.26(d,J＝4.7Hz,1H),4.61(s,1H),3.25(ddd,J＝15.2,10.4,4.4Hz,1H),2.26(t,J＝9.2Hz,1H),2.18–2.02(m,2H),1.95(dd,J＝19.3,11.9Hz,3H),1.76(dd,J＝13.3,3.2Hz,1H),1.73-1.64(m,2H),1.63–1.47(m,3H),1.45–1.30(m,3H),1.28–1.14(m,2H),1.12–1.04(m,1H),1.00(dd,J＝13.6,3.3Hz,1H),0.95–0.86(m,4H),0.63(s,3H).由上述鉴定结果可知，所得白色固体为化合物2。

步骤二：

取318mg(1mmol)步骤一所得到的化合物2溶于无水DMF中，加入HOBt 135mg,加入三乙胺4滴,再加入EDCI 192mg，最后加入咪唑68mg搅拌过夜。反应结束后加水析出白色固体。

上述步骤二的化学反应式如下：

将所得到的化合物采用核磁共振谱进行鉴定，鉴定结果为¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.44(s,1H),7.73(s,1H),7.06(s,1H),5.28(d,J＝3.1Hz,1H),4.59(d,J＝4.4Hz,1H),3.41(t,J＝8.8Hz,1H),3.29–3.20(m,1H),2.14(dt,J＝35.9,11.9Hz,3H),1.93(dd,J＝33.6,11.3Hz,2H),1.71(dd,J＝29.3,10.3Hz,3H),1.55(dd,J＝27.2,11.6Hz,4H),1.40–1.21(m,5H),1.08–0.88(m,5H),0.65(s,3H)。由上述鉴定结果可知，所得产物为化合物3，即式(I)所示甾体衍生物。

实施例2(细胞实验研究)

一、实验目的及原理

实验目的：采用NO抑制试验检测合成的一系列甾体类化合物对LPS刺激的巨噬细胞产生的NO抑制效果。

实验原理：NO在体内或水溶液中极易氧化生成NO₂ ^-，在酸性条件下，NO₂ ^-与重氮盐磺胺发生重氮反应，并生成重氮化合物，后者进一步与萘基乙烯基二胺发生偶合反应，该反应生成的产物浓度与NO₂ ^-浓度具有线性关系，在540nm-560nm处有最大吸收峰。

二、试剂基本信息

三、试剂配制

1、RPMI-1640完全培养基

将50mL血清悬空倒入450mL RPMI-1640培养基中，然后按照1:100的比例加入5mL青霉素-链霉素溶液，使其成完全培养基，即可用于细胞培养。

2、Griess试剂配制

2.1 10mM NaNO2标准储存液的配制：精确称取NaNO₂ 6.9mg，加去离子水定容至10mL，即为10mM NaNO2储存液。

2.2Griess试剂配制

试剂A：浓磷酸(85％)6mL；去离子水70mL；无水对氨基苯磺酸1.0g。将上述试剂充分溶解后，定容至100mL。

试剂B：N-1-萘乙二胺盐酸盐0.1g，溶于去离子水中，定容至100mL。

3、化合物配制

称取1mg上述实施例1所制备的甾体衍生物(化合物Ⅰ)置于经高压灭菌过的EP管中，然后向EP管中加入136μl的DMSO配制成20mM的母液，使用前用完全培养基将母液稀释至40μM，20μM，10μM，5μM，和2.5μM。

四、实验过程

(1)取对数生长期的RAW 264.7细胞，消化后调整细胞数浓度为5×10⁴/mL，按100μL/孔接种到96孔板中。在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养过夜，待细胞贴壁。

(2)吸除原有培养基，每孔加入含LPS(100ng/mL)的培养基100μL，空白组加入不含LPS刺激的培养基100μL，2h后每孔加入100μL配制好的不同浓度的化合物，即化合物实际处理浓度为20μM，10μM，5μM，2.5μM和1.2 5μM。以0.1％的DMSO为阴性对照组，地塞米松(Dex)为阳性对照组。在细胞培养箱中继续培养24h后，每孔取50μL培养基待用。

(3)NO标准液稀释如下

(4)加样：向96孔板中分别加入稀释好的标准应用液或待测样品各50μL。然后向各孔中加入50μL试剂A，于37℃孵箱中反应10min；再向各孔中加入50μL试剂B，于37℃孵箱中反应10min。

(5)将96孔板轻轻振荡数次，待各孔反应液完全混匀后，用酶联免疫检测仪于540nm波长处检测各孔的OD值。根据所得OD值，拟合NO反应标准曲线，并由标准曲线计算各待测样品的NO含量。

(6)按以下公式计算NO抑制率：

抑制率＝[(Al-Ab)-(As-Ab)]/(Al-Ab)×100％

Al：对照孔的吸光度(经LPS刺激，无化合物处理)；As：实验孔的吸光度(经LPS刺激，化合物处理)；Ab：空白孔的吸光度(无细胞)

根据药物在不同剂量下对细胞增殖的抑制率，通过GraphPad Prism 8.2.1软件计算化合物在不同浓度下的抑制率。测得化合物对LPS诱导的NO抑制结果如表1所示：

表1化合物对NO的抑制效果

五、实验结果

NO抑制实验的结果如图1所示，当浓度为5-20μM时，化合物Ⅰ对LPS诱导产生的NO显示出与地塞米松相当或高于地塞米松的活性，其中，浓度为10μM时化合物Ⅰ与地塞米松对NO的抑制活性具有显著性差异。结果表明，化合物Ⅰ在浓度大于10μM具有显著的抑制NO生成的活性。

实施例3(动物实验研究)

一.动物模型

在炎症性肠炎的新药研发过程中，葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate SodiumSalt,DSS)诱导的结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型应用最为广泛。通过给予小鼠自由饮用不同浓度的DSS水溶液，根据用药时间及用药周期可制成急性和慢性两种结肠炎模型。该模型症状表现与人类UC极为相似，主要表现为腹泻、黏液样便、粪便潜血、肉眼血便、重量减轻、活动度减少，毛色变差等。慢性期结肠炎模型主要表现有结肠明显缩短,粘膜增厚、淋巴结肿大，杯状细胞缺失、隐窝缺失，小部分动物出现腺瘤性息肉、肿瘤样改变。急性期结肠炎模型主要表现有结肠充血、水肿、变短、变脆、重量长度比增加，出现不同程度的结肠溃疡，黏膜水肿、杯状细胞缺失、隐窝肿胀破坏，黏膜和黏膜下层出现不同程度的炎症细胞浸润，上皮细胞损伤。

二.实验动物与试剂

动物：c57小鼠，雄性，5周龄

试剂：试剂信息如下表所示

三.试剂配制

1.DSS溶液：将DSS溶于消毒过的饮用水，配制成重量百分浓度为3.5％的DSS溶液。

2.化合物配制：取上述实施例1所制备的甾体衍生物(化合物Ⅰ)溶于盐水，加入蓖麻油、乙醇和DMSO(70：10：15：5)，配制成20mg/mL,10mg/mL,5mg/mL等不同浓度的溶液待用；按照同样方法将地塞米松配制成5mg/mL的溶液待用。

四.实验过程

1.将购买的5周龄C57小鼠饲养于SPF级动物房，饮用正常水一周以适应环境。

2.待小鼠长至约20g时，将小鼠随机分为6组，A组给予正常饮用水；B组给予3.5％的DSS溶液供其随意饮用；C组给予3.5％的DSS溶液供其随意饮用，同时腹腔注射20mg/mL的化合物Ⅰ溶液100μL/只(100mg/kg)；D组给予3.5％的DSS溶液供其随意饮用，同时腹腔注射10mg/mL的化合物Ⅰ溶液100μL/只(50mg/kg)；E组给予3.5％的DSS溶液供其随意饮用，同时腹腔注射5mg/mL的化合物Ⅰ溶液100μL/只(25mg/kg)；F组给予3.5％的DSS溶液供其随意饮用，同时腹腔注射5mg/mL的地塞米松溶液100μL/只(25mg/kg)。

3.记录小鼠拉稀便血等情况。评分标准：(1)大便稠度：0，形成良好的颗粒；2，糊状且不成形的大便，不粘在肛门上；4，液体大便且粘在肛门上。(2)大便出血：0，血液中无血；2，出血；4，大出血。

4.对结肠组织进行HE染色。一周后，将小鼠处死，解剖取其结肠，将样品固定在10％福尔马林中，石蜡包埋，切成薄片，用苏木精和曙红(HE)染色，以200X的放大率在显微镜下观察。

5.对结肠组织进行免疫组织化学分析。将切片除蜡后在柠檬酸盐缓冲液中回收抗原，然后将样品与一抗(CD86，1：200稀释)孵育，再在IgG-HRP抗体(1：200稀释)中孵育。孵育后，样品在二氨基联苯显微镜下显影，用苏木精重新染色，脱水，密封成微片。使用光学显微镜，以400X的放大率观察到结肠结构。

五.实验结果

1.如图2所示，与未经DSS处理的小鼠相比，经DSS处理的小鼠粪便黏度和出血分数显著升高，表现出明显的拉稀便血的炎性症状。治疗组小鼠经不同剂量化合物Ⅰ处理后，其粪便黏度和便血分数均显著降低，其中，50mg/kg化合物Ⅰ处理组的小鼠疾病活动指数最低。结果表明化合物Ⅰ可有效缓解小鼠的结肠炎症。

2.如图3所示，与未经DSS处理的小鼠相比，经DSS处理的小鼠表现出隐窝脓肿，杯状细胞丢失，黏液层丢失，嗜中性白细胞浸润到固有层等病理学特征(图3B)，D组结肠(50mg/kg化合物Ⅰ)炎症细胞减少，且显示出完整的结构(图3D)。结果表明化合物Ⅰ可有效缓解小鼠结肠的炎症。

3.如图4所示，与未经DSS处理的小鼠相比，经DSS处理的小鼠结肠组织内CD86(+)细胞聚集且形成几个显著的阳性群落(图4B)，而在未经DSS处理、经DSS和化合物Ⅰ等组别的小鼠结肠内，CD86(+)细胞处于分散状态(图4A，C,，D，E，F)。结果表明化合物Ⅰ可有效缓解DSS诱导的小鼠结肠炎症。基于此，化合物Ⅰ有望应用于炎症性肠炎即IBD。