一种以喹啉鎓离子为骨架的荧光分子及其标记的多肽或蛋白质与制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白标记荧光分子领域，尤其涉及一种以喹啉鎓离子为骨架的荧光分子及其标记的多肽或蛋白质与制备方法。
背景技术
蛋白质是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的有机大分子，是组成一切生命的物质基础。将荧光分子偶联在蛋白质上用于追踪蛋白分子的作用机理或识别特殊的蛋白分子已成为当前生物化学、药物化学等专业中重要的研究手段。就目前而言，已经商业化的修饰蛋白质的技术主要使用N-羟基琥珀酰亚胺基团对赖氨酸支链上的氮末端进行修饰以及使用马来酰亚胺基团对半胱氨酸支链上的硫醇末端进行修饰。但是由于蛋白质表面往往广泛分布有亲水基团的赖氨酸，因此偶联的位点和数量变得难以控制，无法定量监测荧光变化，更无法用于研究蛋白质的空间结构变化。而马来酰亚胺与半胱氨酸的偶联产物则多次被报道在缓冲溶液中会发生水解断裂的情况。与此同时可用于标记的荧光分子也有很大的局限性，由于合成技术的局限性，目前用于连接于蛋白质上的荧光基团仍局限于荧光素、罗丹明、香豆素、氟硼荧及花青素等结构。其中，除了以氧雜蒽为结构基础的荧光素及罗丹明外，其余结构经修饰后其水溶性较弱，在水溶液中量子产率较差，修饰后容易导致蛋白质变性，应用范围较窄。而荧光素和罗丹明的发光性质则会受到pH的影响，因此，分子的亲疏水性对修饰后蛋白质的结构、功能以及光物理性质皆会产生影响。因此，发展新的荧光分子并将之应用于蛋白或多肽分子中的选择性标记具有重要价值。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种以喹啉鎓离子为骨架的荧光分子及其标记的多肽或蛋白质与制备方法。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供一种以喹啉鎓离子为骨架的荧光分子，其中，所述荧光分子的通式如式I-a、式I-b或式I-c所示：
其中，R1选自氢或苯基；R2选自氢、三氟甲基或甲氧基；X选自氧或氮氢。
本发明的荧光分子包括喹啉鎓离子骨架、通过碳硅单键与所述喹啉鎓离子骨架结构键合的三甲基硅基、以及通过碳碳单键与所述喹啉鎓离子骨架结构相连的对丙炔酰苯基。相比于目前常用的荧光分子如荧光素、罗丹明、香豆素、氟硼荧及花青素等，本发明的荧光分子的合成简单，而且可以简单方便地改变取代基得到不同发光性质的荧光分子。另外，本发明的以喹啉鎓离子为骨架荧光分子能够专一地与半胱氨酸上的硫醇共价结合，从而可用于对活性硫基的蛋白或多肽高选择性生物标记中。
可选地，所述荧光分子选自如下结构式中的一种：
本发明的第二方面，提供一种本发明所述的以喹啉鎓离子为骨架的荧光分子的制备方法，其包括步骤：
将化合物III(喹啉重氮盐)溶于有机溶剂中，加入化合物II-a(三甲基硅基炔衍生物)，以及一价金催化剂(一价金配合物)，在光照和室温(20-30℃)条件下进行反应，生成目标化合物I-a，即所述荧光分子；
或者，将化合物III(喹啉重氮盐)溶于有机溶剂中，加入化合物II-b或化合物II-c(三甲基硅基炔衍生物)，以及一价金催化剂，在光照和室温(20-30℃)条件下进行反应，生成目标化合物I-b，即所述荧光分子；
或者，将化合物III-c(喹啉重氮盐)溶于有机溶剂中，加入化合物II-b(三甲基硅基炔衍生物)，以及一价金催化剂，在光照和室温(20-30℃)条件下进行反应，生成目标化合物I-c，即所述荧光分子；
上述反应路线分别如下所示：
可选地，所述化合物II-a、化合物III和一价金催化剂的摩尔比为1.0：1.5-2：0.05-0.1；
或者，所述化合物II-b或化合物II-c、化合物III和一价金催化剂的摩尔比为1.0：1.5-2：0.05-0.1；
或者，所述化合物II-b、化合物III-c和一价金催化剂的摩尔比为1.0：1.5-2：0.05-0.1。
可选地，所述目标化合物I-a、目标化合物I-b或目标化合物I-c反应的时间均为10-24小时，其可根据TLC板分析原料是否反应完确定得到。
可选地，所述一价金催化剂为三(4-三氟甲基苯基)膦氯化金，其分子式为(4-CF3C6H4)3PAuCl。所述一价金催化剂也可以是三苯基膦氯化金，其分子式Ph3PAuCl。
本发明的第三方面，提供一种荧光分子标记的多肽或蛋白质，所述多肽或蛋白质均含有半胱氨酸，其中，所述荧光分子为本发明所述的以喹啉鎓离子为骨架的荧光分子。
本发明的荧光分子包含喹啉鎓离子骨架、及以碳碳单键与喹啉鎓离子骨架结构相连的对丙炔酰苯基，具体结构如下方通式所示。该类分子上的末端炔基为缺电子，其能够与含半胱氨酸的多肽或蛋白质上的巯基发生亲核取代反应，因此可将该荧光分子高选择性地连接到多肽或蛋白质上，偶联产率中等到良好。利用该类荧光分子成功地实现了对多种多肽和蛋白质的荧光标记。
可选地，所述多肽选自CSKFR、KSTFC、ASCGTN、STSSSCNLSK、AYEMWCFHQK、AYEMWCFHQR中的一种；
或者，所述蛋白质选自牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，简写为BSA)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin，简写为HSA)中的一种。
可选地，所述荧光分子与多肽的摩尔比为1：1到100：1；
或者，所述荧光分子与蛋白质的摩尔比为1：1到100：1。
本发明的第四方面，提供一种本发明所述的荧光分子标记的多肽或蛋白质的制备方法，其包括步骤：将多肽溶液或者蛋白质溶液、荧光分子溶液、缓冲液和溶剂混合，并反应，得到所述荧光分子标记的多肽或蛋白质。
可选地，所述多肽溶液或者蛋白质溶液的浓度为0.01-10mmol/L，其中以水或缓冲液为溶剂。
可选地，所述荧光分子溶液的浓度为2-200mmol/L，其中以乙腈为溶剂。
可选地，所述缓冲液是pH为5.8-8.0的磷酸盐缓冲液，浓度为0-500mmol/L。
本发明中，对得到的所述荧光分子标记的多肽或蛋白质进行分析，所述分析主要是质谱分析。进一步地，对荧光分子标记的多肽的分析包括LC-MS和LC-MS/MS分析；对荧光分子标记的蛋白质的分析包括LC-MS分析。
附图说明
图1a为本发明实施例10中CSKFR─I-a1的LC-MS谱；
图1b为本发明实施例10中CSKFR─I-a1的LC-MS/MS谱
图2a为本发明实施例11中CSKFR─I-b1的LC-MS谱；
图2b为本发明实施例11中CSKFR─I-b1的LC-MS/MS谱
图3a为本发明实施例12中CSKFR─I-c的LC-MS谱；
图3b为本发明实施例12中CSKFR─I-c的LC-MS/MS谱
图4为本发明实施例35中BSA-I-b1的LC-MS谱(m/z 66433→m/z 66875)；
图5为本发明实施例35中BSA-I-b1的LC-MS/MS谱。
具体实施方式
本发明提供一种以喹啉鎓离子为骨架的荧光分子及其标记的多肽或蛋白质与制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：荧光分子I-a1的合成
(1)在氮气氛围下，将4-(2-三甲基硅乙炔基)苯甲醛(2.02g,10mmol)溶解在无水四氢呋喃THF(10mL)中，将反应液冷却至0℃，缓慢滴加乙炔基溴化镁溶液(30mL，浓度为0.5M)，加完后，在室温下继续搅拌过夜。反应完全后，用50mL的饱和的氯化铵水溶液淬灭反应，并用二氯甲烷萃取，合并有机萃取物并用饱和食盐水洗涤一次，经硫酸镁干燥、浓缩。通过柱色谱纯化，得到白色固体IV；(2)向圆底烧瓶中加入摩尔体积比为1：5的化合物IV和二氯甲烷(DCM)，搅拌下分批添加5倍当量的二氧化锰作为氧化剂，加完后在室温下继续搅拌，直至反应完全。反应结束后，用二氯甲烷稀释反应液，并通过硅藻土垫过滤除去过量的二氧化锰。依次用水和盐水洗涤滤液，并用硫酸镁干燥，旋干后得到产物II-a；(3)在惰性气体氮气保护下，将化合物II-a和化合物III-a，还有一价金配合物(4-CF3C6H4)3PAuCl，用5mL溶剂乙腈(CH3CN)溶于30mL的反应管中，在16瓦的蓝色LED灯和室温条件下进行催化环加成反应。反应16个小时后，旋蒸除去有机溶剂，所得残余物过硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，合并旋蒸除去溶剂，加入二氯甲烷后用水多次萃取，合并水相，最后旋蒸除去水，得到化合物I-a1。
化合物I-a1的表征分析数据：橙色固体，产率为49％；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.13(d,J＝9.0Hz,1H),8.92(d,J＝4.4Hz,2H),8.27(t,J＝9.0Hz,3H),8.14(d,J＝7.9Hz,1H),8.05(d,J＝7.7Hz,1H),7.98(d,J＝7.7Hz,1H),7.67–7.60(m,3H),7.50(d,J＝9.0Hz,1H),7.30(s,1H),3.60(s,1H),0.10(s,9H)；
HRMS(ESI)C29H24NOSi+，理论计算值430.1622，实测值430.1623。
实施例2：荧光分子I-a2的合成
具体操作与实施例1基本相同，不同之处在于：将化合物III-a替换成化合物III-b。
化合物I-a2的表征分析数据：黄色固体，产率为25％；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.35(d,J＝8.4Hz,1H),9.27(s,1H),8.59(d,J＝8.0Hz,1H),8.35(d,J＝8.6Hz,2H),8.34–8.25(m,1H),8.21–8.12(m,2H),8.07–7.99(m,4H),7.90(d,J＝8.9Hz,1H),7.83–7.75(m,4H),7.56–7.47(m,1H),4.61(s,1H),0.17(s,9H)；
HRMS(ESI)C35H28NOSi+，理论计算值506.1935，实测值506.1951。
实施例3：荧光分子I-a3的合成
具体操作与实施例1基本相同，不同之处在于：将化合物III-a替换成化合物III-c。
化合物I-a3的表征分析数据：棕色固体，产率为17％；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.00(d,J＝8.3Hz,1H),8.93(d,J＝9.0Hz,1H),8.75(d,J＝7.9Hz,1H),8.27(d,J＝7.2Hz,2H),8.07(d,J＝7.8Hz,1H),7.66–7.54(m,5H),7.44(d,J＝8.6Hz,1H),7.24(t,J＝7.8Hz,1H),4.12(s,3H),3.62(s,1H),0.13(s,9H)；
HRMS(ESI)C30H26NO2Si+，理论计算值460.1727，实测值460.1719。
实施例4：荧光分子I-b1的合成
(1)在氮气保护下，将二环己基碳二亚胺(DCC)(2.48g,12mmol)溶于二氯甲烷(DCM)并保持在-15℃搅拌15分钟，然后滴加丙炔酸(759mg,11mmol)，透明溶液逐渐浑浊，继续搅拌1小时后，再滴加苯胺(1.89g,10mmol)的二氯甲烷溶液，加完后继续在-15℃搅拌过夜，然后第二天在室温反应整天。在布式漏斗中放入一层脱脂棉，压紧后放入硅胶，然后将反应液倒入，DCC的副产物固体被留在硅胶上层，然后用PE:EA＝2:1的洗脱液洗三次，直到DCC副产物层为白色，旋干滤液直接柱层析得到棕色固体II-b。(2)具体操作与实施例1中步骤(3)基本相同，不同之处在于：将化合物II-a替换成化合物II-b。
化合物I-b1的表征分析数据：黃色固体，产率为41％；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.16(s,1H),9.31(d,J＝9.0Hz,1H),9.12(d,J＝8.4Hz,1H),9.07(d,J＝8.9Hz,1H),8.40(d,J＝8.1Hz,1H),8.32(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),8.23–8.17(m,1H),8.08(t,J＝7.8Hz,1H),7.75–7.70(m,3H),7.62(d,J＝9.0Hz,1H),7.51(d,J＝8.5Hz,2H),7.47–7.37(m,1H),4.52(s,1H),0.07(s,9H)；
HRMS(ESI)C29H25N2OSi+，理论计算值445.1731，实测值445.1790。
实施例5：荧光分子I-b2的合成
具体操作与实施例4基本相同，不同之处在于：将化合物III-a替换成化合物III-d。
化合物I-b2的表征分析数据：黃色固体，产率为43％；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.17(s,1H),9.46(d,J＝9.0Hz,1H),9.37(d,J＝8.8Hz,1H),9.24(d,J＝8.9Hz,1H),8.50(s,1H),8.44–8.35(m,2H),7.83–7.71(m,3H),7.68(d,J＝9.0Hz,1H),7.51(d,J＝8.6Hz,2H),4.54(s,1H),0.09(s,9H)；
HRMS(ESI)C30H24F3N2OSiNa+，理论计算值536.1508，实测值536.1504。
实施例6：荧光分子I-b3的合成
具体操作与实施例4基本相同，不同之处在于：将化合物III-a替换成化合物III-b。
化合物I-b3的表征分析数据：橙黄色固体，产率为45％；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.16(s,1H),9.30(d,J＝8.5Hz,1H),9.21(s,1H),8.40(d,J＝8.3Hz,1H),8.20(t,J＝7.7Hz,1H),8.06(t,J＝7.7Hz,1H),7.98(dd,J＝7.6,1.7Hz,3H),7.76(d,J＝6.7Hz,4H),7.68(t,J＝8.5Hz,3H),7.61(d,J＝8.3Hz,2H),7.46–7.40(m,1H),4.55(s,1H),0.08(s,9H)；
HRMS(ESI)C35H29N2OSi+，理论计算值521.2044，实测值521.2052。
实施例7：荧光分子I-b4的合成
具体操作与实施例4基本相同，不同之处在于：将化合物III-a替换成化合物III-c。
化合物I-b4的表征分析数据：黄色固体，产率为48％；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.16(s,1H),9.15(d,J＝9.1Hz,1H),9.08(d,J＝9.4Hz,1H),8.91(d,J＝9.0Hz,1H),8.25(d,J＝8.0Hz,1H),7.71–7.74(m,3H),7.66(t,J＝7.5Hz,1H),7.58–7.51(m,2H),7.51(d,J＝8.2Hz,2H),7.37(t,J＝8.2Hz,1H),4.51(s,1H),4.13(s,3H),0.09(s,9H)；
HRMS(ESI)C30H27N2O2Si+，理论计算值475.1836，实测值475.1847。
实施例8：荧光分子I-c的合成
具体操作与实施例4基本相同，不同之处在于：将化合物III-a替换成化合物III-c。
化合物I-c的表征分析数据：黄色固体，产率为10％；
1H NMR(400MHz,丙酮-d6)δ10.37(s,1H),9.20(d,J＝8.5Hz,1H),9.14(d,J＝8.5Hz,1H),8.69(d,J＝8.4Hz,1H),8.62(d,J＝7.4Hz,1H),8.47(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),8.36–8.29(m,3H),8.26–8.20(m,1H),8.18–8.13(m,1H),8.11(d,J＝8.2Hz,2H),8.03(s,1H),7.80(d,J＝8.6Hz,2H),3.90(s,1H),0.25(s,9H)；
HRMS(ESI)C29H25N2OSi+，理论计算值445.1731，实测值445.1790。
实施例9：荧光分子I-a、I-b和I-c的光学性质
依上述实验步骤合成的荧光分子I-a、I-b和I-c均在紫色可见光波段被激发，发射出从蓝光到红色的荧光。具体光学参数包括最大吸收波长(λ吸收)、最大发射波长(λ发射)、斯托克斯位移及量子产率，见下表1所示。
表1
实施例10：喹啉鎓骨架的荧光分子I-a1对多肽CSKFR的选择性标记
具体步骤如下：将10μL的CSKFR溶液(水为溶剂，浓度为1mmol/L)，1μL的荧光分子I-a1溶液(乙腈为溶剂，浓度为10mmol/L)，以及80μL的pH＝7.4磷酸盐缓冲液(浓度为50mmol/L)和9μL的乙腈混合在1.5mL离心管中，并置于25℃室温反应2小时。2小时后通过LC-MS和LC-MS/MS分析对修饰多肽产物CSKFR-I-a1进行表征和序列确定，其测试结果见图1a和图1b。
实施例11：喹啉鎓骨架的荧光分子I-b1对多肽CSKFR的选择性标记
具体操作与实施例10基本相同，不同之处在于：将I-a1替换成I-b1。通过LC-MS和LC-MS/MS分析对修饰多肽产物CSKFR-I-b1进行表征和序列确定，其测试结果见图2a和图2b。
实施例12：喹啉鎓骨架的荧光分子I-c对多肽CSKFR的选择性标记
具体操作与实施例10基本相同，不同之处在于：将I-a1替换成I-c。通过LC-MS和LC-MS/MS分析对修饰多肽产物CSKFR-I-c进行表征和序列确定，其测试结果见图3a和图3b。
实施例13：喹啉鎓骨架的荧光分子I-a1对多肽KSTFC的选择性标记
具体操作与实施例10基本相同，不同之处在于：将CSKFR替换成KSTFC。
实施例14：喹啉鎓骨架的荧光分子I-b1对多肽KSTFC的选择性标记
具体操作与实施例11基本相同，不同之处在于：将CSKFR替换成KSTFC。
实施例15：喹啉鎓骨架的荧光分子I-c对多肽KSTFC的选择性标记
具体操作与实施例12基本相同，不同之处在于：将CSKFR替换成KSTFC。
实施例16：喹啉鎓骨架的荧光分子I-a1对多肽ASCGTN的选择性标记
具体操作与实施例10基本相同，不同之处在于：将CSKFR替换成ASCGTN。
实施例17：喹啉鎓骨架的荧光分子I-b1对多肽ASCGTN的选择性标记
具体操作与实施例11基本相同，不同之处在于：将CSKFR替换成ASCGTN。
实施例18：喹啉鎓骨架的荧光分子I-c对多肽ASCGTN的选择性标记
具体操作与实施例12基本相同，不同之处在于：将CSKFR替换成ASCGTN。
实施例19：喹啉鎓骨架的荧光分子I-a1对多肽STSSSCNLSK的选择性标记
具体操作与实施例10基本相同，不同之处在于：将CSKFR替换成STSSSCNLSK。
实施例20：喹啉鎓骨架的荧光分子I-a2对多肽STSSSCNLSK的选择性标记
具体操作与实施例19基本相同，不同之处在于：将I-a1替换成I-a2。
实施例21：喹啉鎓骨架的荧光分子I-a3对多肽STSSSCNLSK的选择性标记
具体操作与实施例19基本相同，不同之处在于：将I-a1替换成I-a3。
实施例22：喹啉鎓骨架的荧光分子I-b1对多肽STSSSCNLSK的选择性标记
具体操作与实施例11基本相同，不同之处在于：将CSKFR替换成STSSSCNLSK。
实施例23：喹啉鎓骨架的荧光分子I-b2对多肽STSSSCNLSK的选择性标记
具体操作与实施例22基本相同，不同之处在于：将I-b1替换成I-b2。
实施例24：喹啉鎓骨架的荧光分子I-c对多肽STSSSCNLSK的选择性标记
具体操作与实施例22基本相同，不同之处在于：将I-b1替换成I-c。
实施例25：喹啉鎓骨架的荧光分子I-a1对多肽AYEMWCFHQK的选择性标记
具体操作与实施例10基本相同，不同之处在于：将CSKFR替换成AYEMWCFHQK。
实施例26：喹啉鎓骨架的荧光分子I-b1对多肽AYEMWCFHQK的选择性标记
具体操作与实施例11基本相同，不同之处在于：将CSKFR替换成AYEMWCFHQK。
实施例27：喹啉鎓骨架的荧光分子I-c对多肽AYEMWCFHQK的选择性标记
具体操作与实施例12基本相同，不同之处在于：将CSKFR替换成AYEMWCFHQK。
实施例28：喹啉鎓骨架的荧光分子I-a1对多肽AYEMWCFHQR选择性标记
具体操作与实施例10基本相同，不同之处在于：将CSKFR替换成AYEMWCFHQR。
实施例29：喹啉鎓骨架的荧光分子I-b1对多肽AYEMWCFHQR选择性标记
具体操作与实施例10基本相同，不同之处在于：将CSKFR替换成AYEMWCFHQR。
实施例30：喹啉鎓骨架的荧光分子I-b2对多肽AYEMWCFHQR选择性标记
具体操作与实施例29基本相同，不同之处在于：将I-b1替换成I-b2。
实施例31：喹啉鎓骨架的荧光分子I-b3对多肽AYEMWCFHQR选择性标记
具体操作与实施例31基本相同，不同之处在于：将I-b1替换成I-b3。
实施例32：喹啉鎓骨架的荧光分子I-b4对多肽AYEMWCFHQR选择性标记
具体操作与实施例31基本相同，不同之处在于：将I-b1替换成I-b4。
实施例33：喹啉鎓骨架的荧光分子I-c对多肽AYEMWCFHQR选择性标记
具体操作与实施例12基本相同，不同之处在于：将CSKFR替换成AYEMWCFHQR。
实施例34：上述实验操作得到的荧光标记的多肽化合物，均能在LC-MS分析得出转化率，具体转化率参数如下表2所示。
表2
实施例35：喹啉鎓骨架的荧光分子I-b1对牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)的选择性标记
具体操作如下：将10μL的牛血清白蛋白溶液(BSA溶液，其中水为溶剂，浓度为1mmol/L)，10μL的荧光分子I-b1溶液(乙腈为溶剂，浓度为10mmol/L)，以及80μL的pH＝7.4磷酸盐缓冲液(浓度为50mmol/L)置于1.5mL离心管中混合。将反应混合物在25℃下反应16小时。结束后对荧光分子标记的牛血清白蛋白进行Bio-Spin P6純化，进行拍照、LC-MS分析以及胰蛋白酶消化以进行LC-MS/MS分析。另外，以不含半胱氨酸的LYSOZYME作为对照蛋白并重复以上操作。
其中LC-MS分析，其测试结果见图4。
其中LC-MS/MS分析，其测试结果见图5。
实施例36：喹啉鎓骨架的荧光分子I-c对牛血清白蛋白的选择性标记
具体操作与实施例35基本相同，不同之处在于：将I-b1替换成I-c。
实施例37：喹啉鎓骨架的荧光分子I-b1对人血清白蛋白(Human Serum Albumin，简写为HSA)的选择性标记
具体操作与实施例35基本相同，不同之处在于：将BSA替换成HSA。
具体操作与实施例35基本相同，不同之处在于：将I-b1替换成I-c，BSA替换成HSA。
实施例38：上述实验操作得到的荧光标记的蛋白化合物，均能在LC-MS分析得出转化率，具体转化率参数如下表3所示。
表3
实施例39：对上述实验操作得到的荧光标记的蛋白化合物与不含半胱氨酸残基的溶菌酶(Lysozyme)作为对照蛋白在裸眼和紫外灯下进行拍照比较，如下表4所示。实验结果显示不含半胱氨酸残基的溶菌酶(Lysozyme)溶液在加入荧光分子I-b1和I-c前后没有变化，不显示荧光，只有含有半胱氨酸残基的牛血清白蛋白BSA和人血清白蛋白HAS在加入荧光分子I-b1和I-c后表现出强荧光。说明这类荧光分子对能够高选择性地物标记活性硫基的蛋白。
表4
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
