一种有机染料化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于发光化合物
技术领域
，尤其涉及一种有机染料化合物及其制备方法和应用。背景技术
理解大脑高速信息处理过程中单个神经元及其连接的功能是脑科学研究的一个终极目标。这就需要在细胞以及亚细胞尺度上，以毫秒级时间分辨率对神经元动作电位进行快速记录。由于能够实时高通量地记录神经元活动，荧光成像在众多活体成像模式中脱颖而出，成为神经科学研究的重要技术手段。近年来，文献中报道了大量对于神经信号(如膜电位、钙离子、谷氨酸盐等)响应的荧光探针。然而，这些染料发射的荧光主要集中在可见区(400-700nm)，生物组织的穿透性差，现阶段神经信号的荧光成像必须依赖开窗或介入手段而且局限于浅表，这无法满足脑科学研究对人类自身大脑探索的需求。
近红外荧光成像利用近红外光波长长、散射低、在生物组织中穿透深度大的优势，因此可以实现在无创条件下生物体内深处的生理过程进行成像。相比于多光子成像，它使用宽场成像，成像速度快，因此可以实现对生物体内一些快速生理过程的实时记录。如果想要使用近红外荧光成像记录神经元膜电位的变化，就必须使用发射波长在近红外区域的近红外荧光探针，而这类探针还未见报道。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明第一个方面提出一种式I化合物，其发射波长在近红外波段，可以插入细胞膜内。
本发明的第二个方面提出了一种上述式I化合物的制备方法。
本发明的第三个方面提出了一种包括上述式I化合物或上述式I化合物的制备方法制得的式I化合物的有机染料。
本发明的第四个方面提出了一种包括上述式I化合物或由上述式I化合物制备方法制得的式I化合物或上述有机染料的荧光探针。
本发明的第五个方面提出了一种上述式I化合物或由上述式I化合物制备方法制得的式I化合物或上述有机染料或上述荧光探针的应用。
根据本发明的第一个方面，提出了一种式I化合物：
或其生物学上可接受的盐、类似物；其中，
R1、R2各自独立为H、甲基、乙基、丁基、苯基、3-丙酸基或2-乙磺酸基；或R1为羧酸丁酰基、4-琥珀酰亚胺酯丁酰基或2-(N,N,N-三甲基溴化铵基)乙基，R2为H；或R1与R2结合为丙撑基或重氮基；
R3为H，或与R1、R2结合为丙撑基；
R4为H或甲氧基；
R5、R6各自独立为H；或R5、R6结合为3,4-乙烯二氧基或3,4-乙烯二亚胺基；或R5为2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基、R6为H；
R7为H或F；
R8选自式A～式I所示结构中的任意一种：
其中，R9为甲基、2-乙酸基、2-乙酸琥珀酰亚胺酯基、2-乙磺酸基或N,N,N-三甲基溴化铵基甲基；
R10为H或磺酸基。
本发明中，式I化合物，其中所述的词语“生物学可接受的盐”，指在可靠的生物学判断范围内，适用于与活细胞、实验动物接触而不出现过度的毒性、刺激等，且与合理的效果/风险比相称的盐。所述盐可通过使本发明化合物的游离碱性官能团与合适的无机酸或有机酸反应，在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备或者单独制备。代表性的酸加成盐包括但不限于：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、高氯酸盐、四氟硼酸盐。所述盐可通过使本发明化合物的含羧酸、磺酸部分与适当的碱反应，在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，所述的碱加成盐包括但不限于基于碱金属或碱土金属的阳离子例如锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。
本发明式I化合物，其中所述词语“类似物”包括其异构体、消旋体、对映体、非对映体、对映体富集物、溶剂合物和酯；本发明式I化合物及其异构体、消旋体、对映体、非对映体、对映体富集物、溶剂合物和酯还可以形成溶剂合物，例如水合物、醇合物等；选择和制备适当的类似物是本领域技术人员公知技术。一般来说，对于本发明的目的，与生物学可接受的溶剂如水、乙醇等溶剂合物形式与非溶剂合物形式相当。而这些改变并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
本发明使用的所有化合物名称术语具有本领域技术人员公知的一般含义，可参照中国化学会有机化合物命名审定委员会发布的《有机化合物命名原则》2017年版。
在本发明的一些实施方式中，所述式I化合物选自下列化合物中的任意一种或其生物学可接受的盐、溶剂合物：
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(3-丙磺酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(3-丙酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(3-丙磺酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-二丁氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(3-丙酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-二丁氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(3-丙酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-二(2-乙磺酸基)氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-乙基-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(3-丙磺酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(3-丙酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(3-丙磺酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-二苯基氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(3-丙酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-叠氮基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-环丁胺基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-二(3-丙酸基)氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(3-丙酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(2-三甲基溴化铵基)乙氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(3-丙酸琥珀酰亚胺酯基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(2-三甲基溴化铵基)乙氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(4-羧酸丁酰胺基)苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(4-琥珀酰亚胺酯丁酰胺基)苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(2-三甲基溴化铵基乙基)氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-苯并[d]噻唑、
3-乙基-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(2-三甲基溴化铵基乙基)氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-苯并[d]噻唑、
1-(3-丙磺酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-3H-苯并[c,d]吲哚、
2,6-二苯基-4-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)硫代吡喃鎓、
2-苯基-7-二甲氨基-4-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)苯并[b]吡喃鎓、
2-(4-甲氧基苯基)-6-二乙氨基-4-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)苯并[b]硫代吡喃鎓、
9-二乙胺基-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)亚甲基)二苯并[b,e]吡喃鎓、
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(9-久洛利定基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(7-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-噻吩并[3,4-b]吡嗪-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(5,6-二氟-7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚、
1-乙基-4-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)喹啉、
10-乙基-9-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)吖啶、
1-(3-丙磺酸基)-4-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)喹啉、
10-(3-丙磺酸基)-9-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)吖啶。
根据本发明的第二个方面，提出了一种式I化合物的制备方法，包括以下步骤：
S1：式II化合物：
与式III化合物：
在三(邻甲基苯基)膦、乙酸钯(Pd(OAc)2)和三乙胺(TEA)存在的条件下进行反应得到中间产物IV：
S2：使式IV化合物与甲基三苯基碘化膦(CH3PPh3I)在有机碱存在的条件下在有机溶剂中进行反应得到中间产物V：
S3：式V化合物与式VI化合物：
在三(邻甲基苯基)膦、Pd(OAc)2和TEA存在的条件下进行反应得到中间产物VII：
S4：使式VII化合物与式a～式i化合物中的任意一种：
在有机溶剂中进行反应得到式I化合物或其中间产物IX；
其中，R1、R2各自独立为H、甲基、乙基、丁基、苯基；或R1为叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)或9-芴基甲氧羰基(Fmoc)，R2为H；R3～R7、R9～R10的定义如前面所述。
在本发明的一些实施方式中，所述有机碱选自叔丁醇钾(tBuOK)、丁基锂(nBuLi)中的任意一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述有机溶剂可为四氢呋喃(THF)、乙酸酐、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的任意一种。
在本发明的一些更优选的实施方式中，式I化合物的制备方法包括如下步骤：所述中间产物IX在酸性条件下脱保护，并与溴丙酸、氯乙磺酸、2-溴乙基三甲基溴化铵、丁二酸酐或叠氮化钠(NaN3)，在适宜条件下反应得到式I化合物或其中间产物X。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述的反应溶剂对于溴丙酸、氯乙磺酸、2-溴乙基三甲基溴化铵或丁二酸酐包括碱和有机溶剂，所述碱可为三乙胺(TEA)、二异丙基乙胺(DIPEA)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)；所述的反应溶剂对于叠氮化钠，包括盐酸、亚硝酸钠和水溶剂。
在本发明的一些更优选的实施方式中，式I化合物的制备方法包括如下步骤：所述中间产物X在二环己基碳二亚胺(DCC)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)存在下与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在有机溶剂中进行反应得到式I化合物。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述的式III、VI，部分化合物是可以商业获取的，其他的式III、VI化合物，以及式II、VIII化合物是本领域技术人员根据已有技术可以制备的。在一个示例性的方法中，式II、VIII化合物可以参照文献制备，例如，参见：Michael J.Patrick,et al.Org.Biomol.Chem.,2007,5,3347-3353。
以上反应方案中所用的中间体、原材料、试剂、反应条件等均可以根据本领域技术人员已有指示作适当改变，或者对其中部分或者全部技术特征极性等同替换，而这些改变或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
根据本发明的第三个方面，提出了一种有机染料，包括上述式I化合物或由上述式I化合物制备方法制得的式I化合物。该有机染料发射荧光的强度随着细胞膜电位变化而变化。
根据本发明的第四个方面，提出了一种荧光探针，包括上述式I化合物或由上述式I化合物制备方法制得的式I化合物或上述有机染料。
根据本发明的第五个方面，提出了一种上述式I化合物或由上述式I化合物制备方法制得的式I化合物或上述有机染料或上述荧光探针在细胞膜电位检测中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述应用包括使用上述式I化合物或上述式I化合物制备方法制得的式I化合物或上述有机染料，通过其固体粉末、水相溶液、有机相溶液，或通过表面活性剂包载，以任意浓度将其加入细胞培养体系，浸泡离体组织、器官，或直接注入活体实验动物体内，并在激发光照射下，在近红外波段对上述细胞、离体的组织、器官或活体实验动物进行成像。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述应用包括用于离体培养的细胞，离体的组织、器官，活体小动物的深度光学成像，包括但不限于离体培养的细胞，来源于实验动物的离体脑组织、心肌组织，离体心脏、大脑，活体实验动物的心脏、大脑。具体为：使用上述式I化合物或上述式I化合物制备方法制得的式I化合物或上述有机染料，通过其固体粉末、水相溶液、有机相溶液，或通过表面活性剂包载，以一定浓度将其加入细胞培养体系，浸泡离体组织、器官，或直接注入活体实验动物体内，在激发光照射下，在近红外波段(>800nm)对上述细胞、离体的组织、器官或活体实验动物进行成像。
本发明的有益效果为：
1.本发明的式I化合物及其所形成的荧光探针，其发射荧光波长在近红外波段，可以插入细胞膜内并且发射荧光强度对细胞膜的跨膜电位有响应。
2.包含本发明式I化合物的荧光探针，可以实现在近红外波段对细胞膜电位进行检测，克服了传统荧光成像方法在生物组织内的穿透深度差的缺点，可以进一步实现在无创条件下对活体实验动物的神经信号进行实时记录。相比于多光子成像技术，成像速度快10倍以上，对设备要求低，且可以同时对多个神经元的神经信号进行记录。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1化合物1的吸收光谱和荧光发射光谱。
图2为本发明实施例1化合物1所形成的分子探针对细胞膜跨膜电位的响应能力。
图3为本发明实施例1化合物1所形成的红外探针的PBS溶液对神经元膜电位记录的结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
表1给出式I化合物34个具体化合物：式I化合物：
R8选自式A～式I所示结构中的任意一种：
表1
对应地，式I化合物的具体化合物为：
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物1)
3,3-二甲基-1-(3-丙磺酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物2)
3,3-二甲基-1-(3-丙酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物3)
3,3-二甲基-1-(3-丙磺酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-二丁氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物4)
3,3-二甲基-1-(3-丙酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-二丁氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物5)
3,3-二甲基-1-(3-丙酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-二(2-乙磺酸基)氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物6)
3,3-二甲基-1-乙基-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-3H-苯并[e]吲哚(化合物7)
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物8)
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物9)
3,3-二甲基-1-(3-丙磺酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物10)
3,3-二甲基-1-(3-丙酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物11)
3,3-二甲基-1-(3-丙磺酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-二苯基氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物12)
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物13)
3,3-二甲基-1-(3-丙酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-叠氮基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物14)
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-环丁胺基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物15)
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-二(3-丙酸基)氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物16)
3,3-二甲基-1-(3-丙酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(2-三甲基溴化铵基)乙氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物17)
3,3-二甲基-1-(3-丙酸琥珀酰亚胺酯基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(2-三甲基溴化铵基)乙氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物18)
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(4-羧酸丁酰胺基)苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物19)
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(4-琥珀酰亚胺酯丁酰胺基)苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物20)
3-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(2-三甲基溴化铵基乙基)氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-苯并[d]噻唑(化合物21)
3-乙基-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(2-三甲基溴化铵基乙基)氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-苯并[d]噻唑(化合物22)
1-(3-丙磺酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-3H-苯并[c,d]吲哚(化合物23)
2,6-二苯基-4-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)硫代吡喃鎓(化合物24)
2-苯基-7-二甲氨基-4-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)苯并[b]吡喃鎓(化合物25)
2-(4-甲氧基苯基)-6-二乙氨基-4-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)苯并[b]硫代吡喃鎓(化合物26)
9-二乙胺基-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)亚甲基)二苯并[b,e]吡喃鎓(化合物27)
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(9-久洛利定基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物28)
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(7-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)-噻吩并[3,4-b]吡嗪-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物29)
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(5,6-二氟-7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物30)
1-乙基-4-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)喹啉(化合物31)
10-乙基-9-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)吖啶(化合物32)
1-(3-丙磺酸基)-4-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)喹啉(化合物33)
10-(3-丙磺酸基)-9-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)吖啶(化合物34)
下列给出化合物1、化合物14、化合物19、化合物20的制备方法，其他化合物的制备方法与化合物1、化合物14、化合物19、化合物20的制备方法类似。
实施例1
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物1)的合成：
S1：5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-甲醛的合成：
在厚壁耐压管中加入0.89g的2-甲氧基-4-二甲氨基苯基乙烯(5.0mmol)，0.955g的5-溴-2-噻吩基甲醛(5.0mmol)，20mg的Pd(OAc)2、40mg的三(邻甲苯基)膦和5mL干燥的TEA，冻融脱气三次，114℃反应72h，冷却至室温，加入50mL的CHCl3和50mL水，分液，水相用CHCl3洗两次，合并有机相，用饱和NaCl溶液洗，MgSO4干燥，抽滤，蒸干溶剂，得到橙棕色油状粗产物1.84g。柱层析，使用CH2Cl2：正己烷＝0.4:0.7的混合溶剂做洗脱剂，得到暗橙色的油状产物0.86g，产率59.9％。
S2：2-乙烯基-5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩的合成：
4.3g的5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-甲醛(15.0mmol)、12.2g的CH3PPh3I(30.0mmol)和3.5g的tBuOK(31.5mmol)溶于40mL四氢呋喃(THF)，加热至66℃反应3h，冷却至室温，抽滤。滤饼使用柱层析分离，以正己烷为洗脱剂，得到黄色固体3.55g，产率82.9％。
S3：7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-甲醛的合成：
将3.91g的7-溴-2,1,3-苯并噻二唑-4-甲醛(16.7mmol)、3.82g的2-乙烯基-5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩(13.4mmol)、30.9mg的Pd(OAc)2、84.7mg的三(邻甲苯基)膦溶于6.15mL TEA，置于厚壁耐压管中，冻融脱气三次，120℃加热反应24h，冷却至室温搅拌过夜，加入50mL CH2Cl2和50mL水，分液，水相用40mL CH2Cl2洗两次，合并有机相，MgSO4干燥，旋蒸浓缩。柱层析，以乙酸乙酯和正己烷的混合溶剂为洗脱剂，得到紫色固体产物3.51g，产率58.5％。
S4：3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物1)的合成：
0.45g的7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-甲醛(1.0mmol)和0.52g的2,3,3-三甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(1.0mmol)溶于4.0mL乙酸酐(Ac2O)，在N2氛围中加热至110℃，并保持46min，冷却至室温，加入8.0mL异丙醇，-20℃冷却过夜，蒸干溶剂，粗产物溶于CHCl3，柱层析，以甲醇：CHCl3＝0.3:0.6的混合溶剂为洗脱剂，得到深蓝绿色固体产物0.42g，产率47.5％。
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6,δppm):9.07(d,1H,J＝1.5Hz),8.49(d,1H,J＝1.5Hz),8.02(d,1H,J＝7.5Hz),7.97(d,1H,J＝7.5Hz),7.75(d,1H,J＝7.5Hz),7.65(d,1H,J＝7.5Hz),7.22(d,1H,J＝15.1Hz),7.16(d,1H,J＝7.5Hz),7.08(d,2H,J＝7.5Hz),6.99(d,1H,J＝15.1Hz),6.95(d,1H,J＝15.1Hz),6.82(d,1H,J＝15.1Hz),6.79(d,1H,J＝15.1Hz),6.45(dd,1H,J＝1.5Hz,J＝7.5Hz),6.32(d,1H,J＝1.5Hz),5.67(d,1H,J＝15.1Hz),4.47(t,2H,J＝7.1Hz),3.90(s,3H),3.30(m,11H),2.90(s,6H),1.57(s,6H).
实施例2
3,3-二甲基-1-(3-丙酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-叠氮基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物14)的合成：
S1～S4步骤与上述实施例1中类似，在此只展示合成步骤示意图：
其中值得注意的是，S4步骤中在Ac2O为溶剂反应，可以直接得到脱除叔丁氧羰基保护的产物。
S5：3,3-二甲基-1-(3-丙酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-叠氮基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物14)的合成：
将44mg的NaNO2(0.6mmol)溶于1.4mL水，冰水浴冷却，另将488mg的3,3-二甲基-1-(3-丙酸基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(0.5mmol)溶于7.8mL的4M的HCl溶液中，逐滴加入上述NaNO2溶液中，继续冰水浴搅拌反应30min。再将42mg的NaN3(0.6mmol)溶于1.7mL水，逐滴加入上述溶液中，继续冰水浴搅拌反应30min，恢复至室温反应过夜。使用乙酸乙酯萃取，再用饱和NaHCO3溶液洗，MgSO4干燥，蒸干溶剂，即得产物0.25g，产率50.7％。
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6,δppm):8.30(d,1H,J＝1.5Hz),7.97(d,1H,J＝7.5Hz),7.77(dd,2H,J＝1.5Hz,J＝7.5Hz),7.71(d,1H,J＝1.5Hz),7.65(d,1H,J＝7.5Hz),7.51(d,2H,J＝7.5Hz),7.19(dd,2H,J＝1.5Hz,J＝7.5Hz),6.99-6.95(m,4H),6.79(d,1H,J＝15.1Hz),5.67(d,1H,J＝15.1Hz),4.30(t,2H,J＝7.1Hz),4.28(t,4H,J＝7.1Hz),2.30(t,2H,J＝7.1Hz),1.57(s,6H)
实施例3
3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(4-琥珀酰亚胺酯丁酰胺基)苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物20)的合成：
S1～S4步骤与实施例1中类似，在此只展示合成步骤示意图：
S5：3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(4-羧酸丁酰胺基)苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物19)的合成：
177mg的3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-氨基苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(0.2mmol)溶于5mL DMF，依次加入40.2mg琥珀酸酐(0.4mmol)、27mg的DMAP(0.2mmol)和31μL TEA(0.2mmol)，室温搅拌反应12h，蒸干溶剂。粗产物溶于少量丙酮，加入乙醚重结晶，得到棕色固体产物0.18g，产率91.5％。
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6,δppm):9.97(bs,1H),8.30(d,1H,J＝1.5Hz),7.97(d,1H,J＝7.5Hz),7.91(dd,2H,J＝1.5Hz,J＝7.5Hz),7.75(dd,2H,J＝1.5Hz,J＝7.5Hz),7.71(d,1H,J＝1.5Hz),7.65(d,1H,J＝7.5Hz),7.51(d,2H,J＝7.5Hz),6.99-6.95(m,4H),6.79(d,1H,J＝15.1Hz),5.67(d,1H,J＝15.1Hz),4.47(t,2H,J＝7.1Hz),4.28(t,4H,J＝7.1Hz),3.30(m,11H),2.70(t,2H,J＝7.1Hz),2.47(t,2H,J＝7.1Hz),1.57(s,6H).
S6：3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(4-琥珀酰亚胺酯丁酰胺基)苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(化合物20)的合成：
305mg的3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(4-(4-羧酸丁酰胺基)苯基)乙烯基)-3,4-乙烯二氧基噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚(0.3mmol)溶于5mL DMF，冰水浴冷却，依次加入44mg的NHS(0.4mmol)和72mg的EDC(0.4mmol)，室温搅拌反应过夜，蒸干溶剂，用乙醚荡洗得到产物0.20g，产率59.7％。
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6,δppm):9.97(bs,1H),8.30(d,1H,J＝1.5Hz),7.97(d,1H,J＝7.5Hz),7.91(dd,2H,J＝1.5Hz,J＝7.5Hz),7.75(dd,2H,J＝1.5Hz,J＝7.5Hz),7.71(d,1H,J＝1.5Hz),7.65(d,1H,J＝7.5Hz),7.51(d,2H,J＝7.5Hz),6.99-6.95(m,4H),6.79(d,1H,J＝15.1Hz),5.67(d,1H,J＝15.1Hz),4.47(t,2H,J＝7.1Hz),4.28(t,4H,J＝7.1Hz),3.30(m,11H),2.70(t,2H,J＝7.1Hz),2.64(t,4H,J＝7.1Hz),2.47(t,2H,J＝7.1Hz),1.57(s,6H).
试验例1
本试验例对本发明化合物的近红外荧光探针的性能进行表征，具体过程为：
将前述实施例1中得到的化合物1，3,3-二甲基-1-(2-三甲基溴化铵乙基)-2-(反-2-(7-(反-2-(5-(反-2-(2-甲氧基-4-二甲氨基苯基)乙烯基)噻吩-2-基)乙烯基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基)乙烯基)-5,7-二磺酸基-3H-苯并[e]吲哚，溶于PBS缓冲液中，得到浓度为3.4μM的溶液，测量其吸收光谱和在785nm激光激发下的荧光发射光谱如附图1所示，在水溶液中，化合物1在696nm处有最大吸收，摩尔吸光系数40.7×103M-1cm-1，荧光发射峰有两个，一个在838nm，另一个在965nm，荧光发射在近红外波段(800-1700nm)，尤其是有一段拖尾进入了近红外二区(1000-1700nm)，绝对荧光量子产率为1.04±0.04％。
表2还提供其他化合物的光学性能表征数据：
表2
附注：“+”表示化合物具有水溶性；“-”表示化合物水溶性差。
试验例2
本试验例测试了部分化合物与蛋白质分子间的相互作用和细胞膜富集的情况，具体过程为：
由于本发明化合物具有两性离子结构，可以降低与蛋白质之间的相互作用，这就使得该探针可以直接注入活体动物体内而不会受体内蛋白的影响。使用本发明化合物培养HEK293T细胞，可以发现，该染料主要富集在细胞膜上。结果如表3所示：
表3
本试验例还测试了本发明化合物所形成的分子探针对细胞膜跨膜电位的响应能力，具体过程为：
使用膜片钳给一个标记本发明化合物染料的细胞加上阶梯式的脉冲电压，可以看到，该细胞的荧光强度随所加电压增大而增大，电压每升高100mV，荧光强度增加17％，如附图2所示。其他化合物所形成分子探针对细胞膜跨膜电位的响应能力如表4所示：
表4
将前述实施例1化合物1所形成的红外探针的PBS溶液，通过脑立体定位注射注入小鼠颅内，在785nm激光激发下，可以直接穿透皮肤和颅骨对小鼠大脑中的神经元进行成像，实现了无创条件下哺乳动物单神经元膜电位的高通量实时记录，结果如图3所示。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
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