一种刺齿凤尾蕨中的化合物及其提取分离纯化方法和应用

技术领域

本发明涉及药学领域，具体涉及一种刺齿凤尾蕨中的化合物及其提取分离纯化方法和应用。

背景技术

刺齿凤尾蕨来源于凤尾蕨科凤尾蕨属植物刺齿凤尾蕨P.dispar Kunze的全草，又称刺齿半边旗，生长于林下、灌丛下、山坡、沟边；资源分布于四川、重庆、湖南、湖北等地。具有清热解毒、凉血祛瘀的功效，民间常将其用于治疗肠炎、痢疾、疮毒等。

目前肿瘤是世界上第一大疾病，发病率非常之高，研发抗肿瘤药物就迫在眉睫，关于刺齿凤尾蕨的研究，从上世纪90年代以来就有学者研究报道，但深入研究的学者却少之又少，前者从该植物中分离得到了约30余种二萜类化合物，其中大多数都具有较好的生物活性，如抗肿瘤、抗菌、抗炎等；研究未见到关于贵州产刺齿凤尾蕨植物化学成分和生物活性报道，因此，对贵州产刺齿凤尾蕨的化学成分进行系统且深入的研究是非常有必要和有意义。

针对以上问题，本发明团队根据药用植物化学分类学的原理，亲缘关系相近的植物具有相同或相似的化学成分。通过研究表明，验证该种植物中含有丰富的二萜化合物，其中化合物对肿瘤细胞表现出较好的抑制作用。由此推断贵州产刺齿凤尾蕨中可能还含有很多新的具有潜在药用价值的二萜化合物，所以后续可以继续加强对该种植物的化学成分和活性筛选研究以及对该种植物中具有较好活性的化合物进行结构修饰方面的研究，期待发现更多的具有较好生物活性的单体化合物，以提供更好的抗肿瘤药。

发明内容

本发明的目的是提供刺齿凤尾蕨中的化合物。

本发明的另一目的是提供一种刺齿凤尾蕨中的化合物提取分离纯化方法。

本发明的另一目的是提供一种刺齿凤尾蕨中的化合物应用。

本发明所述化合物结构式如下：

1)7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide的结构式为：

2)5,11β,12β-trihydoroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid的结构式为：

3)11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid的结构式为：

4)7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯的结构式为：

5)9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid的结构式为：

本发明所述化合物在制备治疗抗肿瘤药物方面的应用。

本发明所述化合物在制备治疗人白血病、人肺癌、人肝癌、人乳腺癌、人结肠癌药物中的应用。

本发明所述药物可以加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的固体制剂或液体制剂。

本发明所述固体制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、冻干粉针剂；

本发明所述液体制剂为注射制剂、口服液。

本发明所述化合物提取分离纯化方法包括以下步骤：

1)药材的提取与粗分离

采集刺，将流分进行薄层检识，合并相同部位得到4个部分H-1、H-2、H-3、H-4，将H-1和H-2再次用硅胶柱色谱进行分离，均依次用比例为20∶1、10∶1的二氯甲烷-乙酸乙酯与20∶1、10∶1、5∶1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，流分析出晶体，经重结晶纯化得到化合物7为7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide、化合物8为5,11β,12β-trihydorox y-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid、化合物9为11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic a cid；将H-3和H-4再次用硅胶柱色谱进行分离，均以比例为20∶1、15∶1、10：1的二氯甲烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱、再用比例为20∶1、10∶1、8∶1、5∶1的二氯甲烷-甲醇系统进行洗脱，白色条状结晶化合物10为7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯、白色方晶化合物11为9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid；

取I部分样品，用100～200目等量的硅胶进行拌样，以比例为50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1的二氯甲烷-甲醇依次进行梯度洗脱，流分析出结晶，将结晶反复重结晶进行薄层检识，化合物9为11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid。

优选的，本发明药材的提取与粗分离方法为：采集刺齿凤尾蕨鲜药材74.15kg，经过自然干燥、粉碎，30～60目过筛，即得粗粉29.9kg，粗粉先用2倍/次95％工业甲醇常温浸渍提取，再用2倍90％甲醇常温浸渍提取一次，最后用2倍70％甲醇常温浸渍提取一次，浸提液在55℃下进行减压浓缩至密度为1.06的浸膏，再用1.25倍温水稀释，稀释后用等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取完成后，将萃取液合并在55℃下进行减压浓缩，浓缩至密度为1.06的乙酸乙酯部位浸膏；

优选的，本发明步骤1)所述常温浸渍提取，具体为：浸泡提取4-6次，每次时间为4-6天，合并提取液；

进一步优选的，本发明步骤1)所述常温浸渍提取，具体为：浸泡提取5次，每次时间为5天，合并提取液。

本发明有益效果：

1、本发明人根据药用植物化学分类学的原理，亲缘关系相近的植物具有相同或相似的化学成分。通过研究表明，验证该种植物中含有丰富的二萜化合物，其中一些化合物对某些肿瘤细胞系也表现出较好的抑制作用。由此推断贵州产刺齿凤尾蕨中可能还含有很多新的具有潜在药用价值的二萜化合物，所以后续可以继续加强对该种植物的化学成分和活性筛选研究以及对该种植物中具有较好活性的化合物进行结构修饰方面的研究。

2、本发明刺齿凤尾蕨的甲醇常温浸提物化学成分，应用¹H-NMR，¹³C-NMR，2D-NMR等相关波谱数据进行解析鉴定，从刺齿凤尾蕨植物中分离得到5个化合物，化合物分别为7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide、5,11β,12β-trihy-doroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid、11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oicacid、7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯、9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid。

3、本发明研究了化合物对人白血病细胞(HL-60)的抑制作用的试验，结果表明：在40μM浓度下化合物7、8、9、10、11对人白血病细胞(HL-60)有半数抑制活性，抑制率分别为102.49±0.65、104.41±0.03、52.54±1.45、104.33±0.63、103.98±0.96，对白血病HL-60的IC₅₀分别为11.11±0.35、5.452±0.222、36.94±1.86、3.590±0.021、3.523±0.092。

4、本发明研究了化合物对人肺癌细胞(A549)的抑制作用试验，结果表明：在40μM浓度下化合物7、8、10、11对人肺癌细胞(A549)有半数抑制活性，抑制率分别为97.89±0.35、98.47±0.12、99.80±0.11、98.84±0.08；对人肺癌细胞(A549)的IC₅₀分别为15.69±0.82、15.15±0.22、4.602±0.131、5.429±0.114。

5、本发明研究了化合物对人肝癌细胞(SMMC-7721)的抑制活性试验，结果表明：在40μM浓度下化合物7、8、9、10、11对人肝癌细胞(SMMC-7721)有半数抑制活性，抑制率分别为96.85±0.47、100.02±0.09、69.63±1.69、99.75±0.16、99.39±0.05；对人肝癌细胞(SMMC-7721)的IC₅₀分别为9.541±0.468、7.177±0.515、27.05±0.34、4.005±0.165、4.160±0.066。

6、本发明研究了化合物对人乳腺癌细胞(MCF-7)的抑制活性试验，结果表明：在40μM浓度下化合物7、8、10、11对人乳腺癌细胞(MCF-7)有半数抑制活性，抑制率分别为98.89±0.96、97.99±1.78、97.97±0.16、96.67±1.44；对人乳腺癌细胞(MCF-7)的IC₅₀分别为7.111±0.111、5.809±0.097、4.094±0.301、6.091±0.168。

7、本发明研究了化合物对人结肠癌细胞SW480的抑制活性试验，结果表明：在40μM浓度下化合物7、8、10、11对人结肠癌细胞(SW480)有半数抑制活性，抑制率分别为91.75±1.47、97.16±0.89、85.88±1.60、93.20±0.80；对人结肠癌细胞(SW480)的IC₅₀分别为4.237±0.111，4.662±0.090，1.882±0.168，4.683±0.298。

附图说明

：

图1：受试化合物对人白血病细胞(HL-60)抑制率直观图；

图2：受试化合物对人白血病细胞(HL-60)的IC50值直观图。

图3：阳性对照化合物细胞生长曲线图(人血蛋白)；

图4：受试化合物对人肺癌细胞(A549)抑制率直观图；

图5：受试化合物对人肺癌细胞(A549)的IC50值直观图；

图6：阳性对照化合物细胞生长曲线图(肺癌细胞)；

图7：受试化合物对人肝癌细胞(SMMC-7721)抑制率直观图；

图8：受试化合物对人肝癌细胞(SMMC-7721)的IC50值直观图；

图9：阳性对照化合物细胞生长曲线图(肝癌细胞)；

图10：受试化合物对人乳腺癌细胞(MCF-7)抑制率直观图；

图11：受试化合物对人肝癌细胞(SMMC-7721)的IC50值直观图；

图12：阳性对照化合物细胞生长曲线图(乳腺癌细胞)；

图13：受试化合物对人结肠癌细胞(SW480)抑制率直观图；

图14：受试化合物对人结肠癌细胞(SW480)的IC50值直观图；

图15：阳性对照化合物细胞生长曲线图(结肠癌细胞)。

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。

实施例1化合物的结构式

1)7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide的结构式为：

2)5,11β,12β-trihydoroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid的结构式为：

3)11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid的结构式为：

4)7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯的结构式为：

5)9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid的结构式为：

实施例27β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide的晶体结构

实施例3 11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid的晶体结构

实施例4 9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid的晶体结构

实施例5 7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide的特征

白色条状结晶(吡啶)，难溶于氯仿、石油醚，较易溶于甲醇、乙酸乙酯、吡啶，微溶于二氯甲烷，以比例为20∶1的二氯甲烷-甲醇为展开剂，TLC在UV 254nm下有荧光斑点，10％硫酸-无水乙醇溶液显色：蓝色圆形斑点；¹H-NMR(400MHz，C₅D₅N)δH 6.38(1H，s)，6.03(1H，s，H-17b)，5.75(1H，t，J＝6.1Hz)，5.18(2H，d，J＝13.9Hz，H-17)，4.71(1H，d，J＝6.0Hz)，3.62(1H，s)，3.23(1H，d，J＝6.3Hz)，3.01(1H，dd，J＝9.3，4.5Hz)，2.53(1H，dd，J＝12.1，4.7Hz)，1.12(3H，s，H-20)。¹³C-NMR(101M Hz，C₅D₅N)δC36.9(C-1)，19.2(C-2)，28.9(C-3)，42.0(C-4)，51.0(C-5)，85.5(C-6)，81.1(C-7)，62.2(C-8)，73.1(C-9)，46.2(C-10)，43.2(C-11)，30.7(C-12)，36.9(C-13)，34.2(C-14)，202.1(C-15)，156.2(C-16)，113.1(C-17)，26.5(C-18)，183.8(C-19)，22.1(C-20)；其晶体参数如下：分子式为C₂₀H₂₆O₅，晶系为orthorhombic，晶格单位为 α＝90.00°，β＝90.00°，γ＝90.00°， T＝296(2)K，Z＝1等；

实施例6 5,11β,12β-trihydoroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid的特征

透明针状结晶(甲醇)，化合物难溶于二氯甲烷、氯仿、石油醚，较易溶于甲醇、吡啶，以比例为20∶1的二氯甲烷-甲醇为展开剂，，Rf＝0.8，TLC在波长为254nm下有荧光斑点，10％硫酸-无水乙醇显色：淡紫色横条形斑点，¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)δH5.74(1H，s)，5.24(1H，s)，5.13(1H，t，J＝6.2Hz)，4.59(2H，s)，4.18(1H，d，J＝6.0Hz)，3.35(1H，s)，3.04(1H，dd，J＝9.5，4.6Hz)，2.79(1H，d，J＝6.3Hz)，2.27-2.20(1H，m)，2.14-2.06(3H，m)，2.00(1H，dd，J＝14.6，6.0Hz)，1.82(1H，td，J＝12.6，6.5Hz)，1.55(3H，dd，J＝10.7，4.9Hz)，1.38(2H，dd，J＝11.5，5.9Hz)，1.31(3H，s)，1.27-1.21(1H，m)，0.90(3H，s)。¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)δC 203.6(C-15)，184.9(C-19)，155.3(C-16)，113.4(C-17)，85.1(C-12)，80.5(C-5)，72.5(C-11)，61.5(C-8)，45.7(C-9)，43.1(C-4)，41.4(C-10)，36.6(C-13)，33.4(C-14)，31.8(C-1)，30.1(C-7)，28.0(C-3)，26.7(C-6)，25.6(C-18)，21.1(C-20)，18.5(C-2)；

实施例7 11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid的特征

透明针状结晶(甲醇)，化合物难溶于二氯甲烷、氯仿、石油醚，较易溶于甲醇、吡啶，以比例为20∶1的二氯甲烷-甲醇为展开剂，Rf＝0.7，TLC在波长为254nm下有紫红色荧光点，10％硫酸-无水乙醇显色：桃红色圆形斑点；¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)δH5.72(1H，s)，5.49(1H，s)，5.24(1H，s)，4.02(1H，d，J＝4.3Hz)，3.03(1H，d，J＝3.5Hz)，2.44(1H，d，J＝11.8Hz)，2.16(1H，d，J＝12.4Hz)，2.09(1H，ddd，J＝14.3，4.7，3.1Hz)，1.97(2H，dd，J＝18.7，2.0Hz，)，1.94(2H，t，J＝4.9Hz)，1.91-1.87(1H，m)，1.86-1.81(2H，m)，1.48-1.43(1H，m)，1.41-1.34(3H，m)，1.23(3H，s)，1.22-1.18(2H，m)，1.14-1.06(2H，m)，0.99(3H，s)。¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)δC212.0(C-15)，181.3(C-19)，152.2(C-16)，112.7(C-17)，66.7(C-11)，63.7(C-9)，57.5(C-5)，52.0(C-8)，44.6(C-4)，41.4(C-12)，40.9(C-1)，40.0(C-10)，39.0(C-3)，38.5(C-13)，37.8(C-7)，35.3(C-14)，29.5(C-18)，21.2(C-6)，20.1(C-2)，16.3(C-20)。其晶体参数如下：分子式为C₂₀H₂₈O₄，晶系为monoclinic，晶格单位为 α＝90.00°，β＝104.654°，γ＝90.00°，T＝293(2)K，Z＝2等；

实施例8 7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯的特征

白色条状结晶(甲醇)，难溶于氯仿、石油醚，易溶于甲醇、乙酸乙酯，微溶于二氯甲烷，以比例为20∶1二氯甲烷-甲醇为展开剂，Rf＝0.7，TLC在UV 254nm下有荧光斑点，10％硫酸-无水乙醇溶液显色：紫色圆形斑点；¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)δH5.84(1H，s)，5.39(1H，s)，5.28(1H，t，J＝6.0Hz)，4.43(1H，d，J＝6.0Hz)，4.27-4.24(1H，m)，3.35(1H，s)，3.13(1H，dd，J＝9.1，4.8Hz)，2.77(1H，d，J＝11.4Hz)，2.33-2.27(1H，m)，2.10(1H，dt，J＝14.4，5.7Hz)，2.04(1H，dd，J＝11.2，4.9Hz)，1.89(1H，d，J＝6.0Hz)，1.77(1H，dd，J＝7.5，4.3Hz)，1.75(1H，t，J＝5.9Hz)，1.65-1.57(1H，m)，1.54(1H，ddd，J＝11.3，10.1，5.7Hz)，1.45-1.38(1H，m)，1.31(3H，s)，1.29(1H，d，J＝3.3Hz)，1.13(3H，s)，1.12-1.09(1H，m)。¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)δC207.3(C-15)，184.9(C-19)，154.5(C-16)，116.3(C-17)，85.4(C-6)，71.5(C-7)，65.8(C-11)，56.8(C-9)，56.4(C-8)，53.7(C-5)，43.6(C-12)，42.8(C-4)，38.0(C-1)，37.6(C-10)，36.6(C-13)，29.9(C-14)，29.4(C-3)，26.2(C-18)，23.2(C-20)，18.4(C-2)；

实施例9 9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid的特征

白色方晶(甲醇)，易溶于二氯甲烷、甲醇，以比例为20∶1的二氯甲烷-甲醇为展开剂，Rf＝0.8，TLC在波长为254nm下有紫红色荧光点，10％硫酸-无水乙醇显色：淡粉色圆形斑点；¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)δH5.91(1H，s)，5.32(1H，s)，3.05(1H，s)，2.64(1H，d，J＝12.5Hz)，2.26-2.21(1H，m)，2.18(1H，dd，J＝15.4，6.0Hz)，2.10(1H，d，J＝13.2Hz)，2.00-1.95(1H，m)，1.92(1H，d，J＝9.7Hz)，1.91-1.88(1H，m)，1.88-1.79(1H，m)，1.79-1.76(1H，m)，1.74(1H，dd，J＝14.5，4.3Hz)，1.51-1.47(1H，m)，1.47-1.45(1H，m)，1.45(1H，dd，J＝7.2，2.6Hz)，1.28(1H，dd，J＝14.3，7.2Hz)，1.24-1.19(3H，m)，1.18(3H，d，J＝9.8Hz)，1.12(1H，dt，J＝13.5，3.0Hz)，1.08-0.99(1H，m)。¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)δC210.0(C-15)，181.8(C-19)，151.0(C-16)，115.2(C-17)，78.1(C-9)，58.2(C-8)，50.3(C-5)，46.2(C-10)，44.8(C-4)，38.9(C-3)，38.9(C-13)，38.4(C-1)，35.1(C-7)，32.6(C-14)，30.8(C-12)，30.6(C-11)，29.6(C-18)，21.4(C-6)，20.0(C-2)，17.8(C-20)。其晶体参数如下：分子式为C₂₀H₂₈O₄，晶系为m onoclinic，晶格单位为α＝90.00°，β＝132.624°，γ＝90.00°，T＝173K，Z＝8等。

实施例10化合物及提取分离纯化方法：

1)药材的提取与粗分离

采集刺齿凤尾蕨鲜药材74.15kg，经过自然干燥、粉碎，30～60目过筛，即得粗粉29.9kg，粗粉先用2倍/次95％工业甲醇常温浸渍提取5次，每次时间为5天，再用2倍90％甲醇常温浸渍提取一次，最后用2倍70％甲醇常温浸渍提取一次，浸提液在55℃下进行减压浓缩，共得到总浸膏7.5kg(密度为1.06)，总浸膏用1.25倍温水稀释，稀释后用等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取完成后，将萃取液合并在55℃下进行减压浓缩，浓缩得到乙酸乙酯部位浸膏348g(密度为1.06)；

2)乙酸乙酯部位分离与纯化

取乙酸乙酯萃取后的浸膏348g，用等量的30～60目的聚酰胺拌样，采用MCI反相柱进行洗脱，首先用50％甲醇/水替换MCI柱中的溶剂，然后依次用50％-100％的甲醇/水系统进行梯度洗脱并分段，得到H部分154.349g，I部分37.855g及其他部分53.323g；其中，H部分的分离纯化为：取H部分样品154.349g，用150目的等量硅胶拌样，干法装柱，依次用比例为20∶1、4∶1的二氯甲烷-乙酸乙酯与10∶1、9∶1、4∶1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，将流分进行薄层检识，合并相同部位得到4个部分H-1、H-2、H-3、H-4，将H-1和H-2再次用硅胶柱色谱进行分离，均依次用比例为20∶1、10∶1的二氯甲烷-乙酸乙酯与20∶1、10∶1、5∶1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，流分析出晶体，经重结晶纯化得到化合物7为7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide，17mg、化合物8为5,11β,12β-trihydoroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid，11mg、化合物9为11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid，1.17g；将H-3和H-4再次用硅胶柱色谱进行分离，均以比例为20∶1、15∶1、10：1的二氯甲烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱、再用比例为20∶1、10∶1、8∶1、5∶1的二氯甲烷-甲醇系统进行洗脱，白色条状结晶化合物10为7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯，19mg)、白色方晶化合物11为9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oicacid，5mg)；I部分的分离纯化为：采用硅胶柱色谱进行分离，将I部分样品37.855g用100-200目等量的硅胶进行拌样，以比例为50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1的二氯甲烷-甲醇依次进行梯度洗脱，流分析出结晶，将结晶反复重结晶进行薄层检识，主要含化合物9为11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid，2g。

化合物的结构式：同实施例1。

化合物的晶体结构：同实施例2、实施例3、实施例4。

化合物的特征：同实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9。

实施例11化合物及提取分离纯化方法：

1)药材的提取与粗分离

采集刺齿凤尾蕨鲜药材74.15kg，经过自然干燥、粉碎过30目筛，得到粗粉25kg，粗粉先用2倍/次80％工业甲醇常温浸渍提取4次，每次时间为4天，再用2倍80％甲醇常温提取一次，最后用2倍60％甲醇常温提取一次，浸提液在50℃下进行减压浓缩，共得到总浸膏5kg(密度为1.06)，总浸膏用1.25倍温水稀释，稀释后用等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取完成后，将萃取液合并在50℃下进行减压浓缩，浓缩得到乙酸乙酯部位浸膏300g(密度为1.06)；

2)乙酸乙酯部位分离与纯化

取乙酸乙酯萃取后的浸膏300g，用等量的30目的聚酰胺拌样，采用MCI反相柱进行洗脱，首先用50％甲醇/水替换MCI柱中的溶剂，然后依次用50％-100％的甲醇/水系统进行梯度洗脱并分段，得到H部分为140g，I部分为30g及其他部分40g；其中，H部分的分离纯化为：取H部分样品140g，用100目的等量硅胶拌样，干法装柱，依次用比例为20∶1、4∶1的二氯甲烷-乙酸乙酯与10∶1、9∶1、4∶1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，将流分进行薄层检识，合并相同部位得到4个部分H-1、H-2、H-3、H-4，将H-1和H-2再次用硅胶柱色谱进行分离，均依次用比例为20∶1、10∶1的二氯甲烷-乙酸乙酯与20∶1、10∶1、5∶1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，流分析出晶体，经重结晶纯化得到化合物7为7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide，17mg、化合物8为5,11β,12β-trihydoroxy-15-oxo-ent-ku ar-16-en-19-oic acid，11mg、化合物9为11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid，1.17g；将H-3和H-4再次用硅胶柱色谱进行分离，均以比例为20∶1、15∶1、10：1的二氯甲烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱、再用比例为20∶1、10∶1、8∶1、5∶1的二氯甲烷-甲醇系统进行洗脱，白色条状结晶化合物10为7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯，19mg)、白色方晶化合物11为9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid，5mg)；I部分的分离纯化为：采用硅胶柱色谱进行分离，将I部分样品37.855g用100-200目等量的硅胶进行拌样，以比例为50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1的二氯甲烷-甲醇依次进行梯度洗脱，流分析出结晶，将结晶反复重结晶进行薄层检识，主要含化合物9为11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid，2g。

化合物的结构式：同实施例1。

化合物的晶体结构：同实施例2、实施例3、实施例4。

化合物的特征：同实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9。

实施例12化合物及提取分离纯化方法：

1)药材的提取与粗分离

采集刺齿凤尾蕨鲜药材74.15kg，经过自然干燥、粉碎过60目筛，得到粗粉35kg，粗粉先用2倍/次98％工业甲醇常温浸渍提取6次，每次时间为6天，再用2倍100％甲醇常温提取一次，最后用2倍80％甲醇常温提取一次，浸提液在60℃下进行减压浓缩，共得到总浸膏10kg(密度为1.06)，总浸膏用1.25倍温水稀释，稀释后用等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取完成后，将萃取液合并在60℃下进行减压浓缩，浓缩得到乙酸乙酯部位浸膏400g(密度为1.06)；

2)乙酸乙酯部位分离与纯化

取乙酸乙酯萃取后的浸膏400g，用等量的60目的聚酰胺拌样，采用MCI反相柱进行洗脱，首先用50％甲醇/水替换MCI柱中的溶剂，然后依次用50％-100％的甲醇/水系统进行梯度洗脱并分段，得到H部分为160g，I部分为40g及其他部分70g；其中，H部分的分离纯化为：取H部分样品160g，用200目的等量硅胶拌样，干法装柱，依次用比例为20∶1、4∶1的二氯甲烷-乙酸乙酯与10∶1、9∶1、4∶1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，将流分进行薄层检识，合并相同部位得到4个部分H-1、H-2、H-3、H-4，将H-1和H-2再次用硅胶柱色谱进行分离，均依次用比例为20∶1、10∶1的二氯甲烷-乙酸乙酯与20∶1、10∶1、5∶1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，流分析出晶体，经重结晶纯化得到化合物7为7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide，17mg、化合物8为5,11β,12β-trihydoroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid，11mg、化合物9为11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid，1.17g；将H-3和H-4再次用硅胶柱色谱进行分离，均以比例为20∶1、15∶1、10：1的二氯甲烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱、再用比例为20∶1、10∶1、8∶1、5∶1的二氯甲烷-甲醇系统进行洗脱，白色条状结晶化合物10为7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯，19mg)、白色方晶化合物11为9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid，5mg)；I部分的分离纯化为：采用硅胶柱色谱进行分离，将I部分样品37.855g用100-200目等量的硅胶进行拌样，以比例为50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1的二氯甲烷-甲醇依次进行梯度洗脱，流分析出结晶，将结晶反复重结晶进行薄层检识，主要含化合物9为11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid，2g。

化合物的结构式：同实施例1。

化合物的晶体结构：同实施例2、实施例3、实施例4。

化合物的特征：同实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9。

实施例13取7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide、5,11β,12β-trihydoroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid、11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid、7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯、9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid任意一种化合物作为原料药，加入20％的微晶纤维素和20％的糖粉制粒，得颗粒剂。

实施例14取7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide、5,11β,12β-trihydoroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid、11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid、7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯、9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid任意一种化合物作为原料药，加入10％的淀粉和3％硬脂酸镁混匀，装入胶囊，得胶囊剂。

实施例15取7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide、5,11β,12β-trihydoroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid、11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid、7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯、9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid任意一种化合物作为原料药，加入10％的淀粉和15％的蜂蜜混合均匀，制成丸剂。

实施例16取7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide、5,11β,12β-trihydoroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid、11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid、7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯、9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid任意一种化合物作为原料药，加入10％的淀粉桨和0.3％的硬脂酸镁，制粒，压片，制成片剂。

实施例17取7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide、5,11β,12β-trihydoroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid、11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid、7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯、9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid任意一种化合物作为原料药，加入12倍量的注射用水，过滤，灭菌，得注射剂。

实施例18取7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide、5,11β,12β-trihydoroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid、11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid、7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯、9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid任意一种化合物作为原料药，加入8倍量的注射用水，过滤，冻干，得冻干粉剂。

实施例19取7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide、5,11β,12β-trihydoroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid、11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid、7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯、9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid任意一种化合物作为原料药，加入12倍量纯净水和0.05％苯甲酸钠，混合均匀，过滤，灭菌，得口服液。

为了进一步验证本发明的可行性及有效性，发明人进行了一系列的试验，具体如下：

(一)化合物的分离与鉴定考察

1仪器及试剂、材料

1.1仪器及试剂

实验中涉及显色剂有三种，分别为10％硫酸-无水乙醇溶液，5％磷钼酸-无水乙醇溶液和2％碘-硅胶。

1.2材料

实验药材(刺齿凤尾蕨)：原植物于2018年7月采收于贵州省黎平县地坪乡，经贵州中医药大学赵俊华教授鉴定其为凤尾蕨科(Pteridaceae)凤尾蕨属(Pteris L.)植物刺齿凤尾蕨(Pteris dispar Kunze)，原植物凭证标本存放于贵州中医药大学中药民族药重点实验室。

凝血质控血浆(COAGULATION quality control plasma)(批号：093B-J186A，厂家：德国TECO公司)；TT试液(批号：30002697，厂家：德国TECO公司生产)；Tris-HCl(批号：20160118，厂家：美国Amresco公司)；PT试液(批号：10002706，厂家：德国TECO公司)；APTT试液(批号：20002745，厂家：德国TECO公司)；CaCl2(批号：031N-J073A，厂家：德国TECO公司)；依诺肝素(LMWH，葛兰素史克，批号：4SH69)。白血病细胞HL-60、肺癌细胞A549、肝癌细胞SMMC-7721、乳腺癌细胞MCF-7、结肠癌细胞SW480、人正常肺上皮细胞BEAS-2B、人正常肝细胞LO2均购自ATCC。胎牛血清(lot：1706126)、RMPI-1640培养基(lot：0023019)、DMEM培养基(lot：0024719)、胰酶(lot：0023518)、双抗(lot：1936917)、磷酸缓冲液PBS(lot：0044818)、二甲基亚砜(lot：B821BA0018)均购自BI。阳性药顺铂(lot：N1001A)、紫杉醇(lot：D1106A)均购自美仑生物科技。MTS试剂盒(lot：0000219904)购自Promega。

2提取与分离

2.1药材的提取与粗分离

采集刺齿凤尾蕨鲜药材74.15kg，经过自然干燥、粉碎得到30～60目的粗粉29.9kg。粗粉先用2倍/次95％工业甲醇常温浸渍提取5次，每次时间为5天，再用2倍90％甲醇常温浸渍提取一次，最后用2倍70％甲醇常温浸渍提取一次，浸提液在55℃下进行减压浓缩，共得到总浸膏7.5kg(密度为1.06，提取率约25.1％)。总浸膏用1.25倍温水稀释，稀释后用等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取完成后，将萃取液合并在55℃下进行减压浓缩，浓缩得到乙酸乙酯部位浸膏348g(密度为1.06)

2.2乙酸乙酯部分的分离与纯化

乙酸乙酯部位样品量348g，用等量的聚酰胺(30-60目)拌样，采用MCI反相柱进行洗脱，首先用50％甲醇/水替换MCI柱中的溶剂，然后依次用50％-100％的甲醇/水系统进行梯度洗脱并分段，得到H部分(154.349g)，I部分(37.855g)及其他部分(53.323g)；再对H-I这2个部分进行分离纯化：

H部分的分离：首先用硅胶柱色谱进行分离，TLC检识，选择了两个系统(二氯甲烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇)，将H部分样品154.349g，取用等量的硅胶(100-200目)拌样，干法装柱，二氯甲烷-乙酸乙酯系统(20∶1、4∶1)与二氯甲烷-甲醇系统(10∶1、9∶1、4∶1)依次进行梯度洗脱，将流分进行薄层检识，合并相同部位得到4个部分(H-1、H-2、H-3、H-4)。将H-1和H-2再次用硅胶柱色谱进行分离，均以二氯甲烷-乙酸乙酯系统(20∶1、10∶1)、二氯甲烷-甲醇(20∶1、10∶1、5∶1)系统为洗脱剂进行洗脱，流分析出晶体，经重结晶纯化得到化合物7(PDY-11，17mg)、化合物8(PDY-11-1，11mg)、化合物9(PDY-12，1.17g)；将H-3和H-4再次用硅胶柱色谱进行分离，均以二氯甲烷-乙酸乙酯系统(20∶1、15∶1、10：1)、再使用二氯甲烷-甲醇(20∶1、10∶1、8∶1、5∶1)系统为洗脱剂进行洗脱，白色条状结晶化合物10(PDY-15，19mg)、白色方晶化合物11(PDY-16，5mg)。

I部分的分离：采用硅胶柱色谱进行分离，将I部分样品37.855g用等量的硅胶(100-200目)进行拌样，以二氯甲烷-甲醇系统(50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1)依次进行梯度洗脱，流分析出结晶，将结晶反复重结晶进行薄层检识，主要含化合物9(PDY-12，2g)。

2.3刺齿凤尾蕨中5个化学成分的结构鉴定

化合物7：白色条状结晶(吡啶)，难溶于氯仿、石油醚，较易溶于甲醇、乙酸乙酯、吡啶，微溶于二氯甲烷。展开剂：二氯甲烷-甲醇(20∶1)，TLC在UV 254nm下有荧光斑点，以10％硫酸-乙醇溶液为显色剂，加热(115℃)显蓝色圆形斑点。根据¹H-NMR(400MHz，C₅D₅N)中δH1.12(3H，s)，1.01(3H，s)是甲基上的氢。¹³C-NMR(101MHz，C₅D₅N)数据可知该化合物含有20个碳，其中δC202.1为一个羰基信号，183.8和85.5显示有一个内酯存在；δC156.2，113.1为一个环外双键；δC 73.1和81.1提示有两个连氧基团。综上，推断该化合物可能为一个二萜类化合物。经过X-ray Diffraction Method进行验证，证实猜想；根据文献，6F的分子量346(EI-MS)，熔点(mp)：220-222℃[14,15]。由以上数据，故鉴定该化合物为7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide，结构式如下；化合物7的¹³C-NMR数据见表1。

表1化合物7与文献的¹³C-NMR数据对比表(δin ppm)

Data¹were recorded in C₅D₅N on a Brucker 400MHz NMR spectrometer.

结构式单晶结构式

化合物8：透明针状结晶(甲醇)，化合物难溶于二氯甲烷、氯仿、石油醚，较易溶于甲醇、吡啶。展开剂：二氯甲烷-甲醇(20∶1，Rf＝0.8)，TLC在波长为254nm下有荧光斑点，以10％硫酸-乙醇溶液为显色剂，加热(115℃)显淡紫色圆形斑点。根据¹H NMR(600MHz，CD₃OD)中δH5.24，5.74为环外双键上的氢；δH0.89(3H，s)，1.31(3H，s)是甲基上的氢。¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)数据可知该化合物含有20个碳，其中δC203.6(C-15)提示含有一个羰基；δC184.9有一个羧基；δC155.3(C-16)，113.4(C-17)为一个环外双键；δC85.1，80.5，72.5提示有三个连氧碳。综上，推断可能是一个ent-kaurane型二萜类化合物。以上数据与文献[6]报道一致，因此确定该化合物为5,11β,12β-trihydoroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oicacid。化合物8的碳谱数据与文献中的¹³C-NMR数据对比见表2，结构式如下。

表2化合物8与文献的¹³C-NMR数据对比表(δin ppm)

Data^8a were recorded in CD₃OD on a Brucker 150MHz NMR spectrometer.

Data^8b were recorded in C₅D₅N on a Brucker 150MHz NMR spectrometer.

结构式

化合物9：透明针状结晶(甲醇)，化合物难溶于石油醚、氯仿、二氯甲烷，易溶于甲醇、吡啶。展开剂：二氯甲烷-甲醇(20∶1，Rf＝0.7)，TLC在波长为254nm下有紫红色荧光点，以10％硫酸-乙醇溶液为显色剂，加热(115℃)显桃红色圆形斑点。根据¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)中δH5.24(H-17)一对烯键质子信号0.99(3H，s)，1.23(3H，s)是甲基上的氢。¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)数据可知该化合物含有20个碳，δC212.5提示含有一个羰基；181.3有一个羧基；152.2，112.7为一个环外双键；66.7提示有一个连氧基团。综上，推断可能是一个二萜类化合物。经过X-ray Diffraction Method进行验证了猜想，以上光谱数据和文献[12]中的5F数据基本一致，故鉴定其为11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid结构式如下；化合物9的碳谱数据与文献中的¹³C-NMR数据见下表3。

表3化合物9与文献的¹³C-NMR数据对比表(δin ppm)

Data^9a were recorded in CD₃OD on a Brucker 150MHz NMR spectrometer.

Data^9b were recorded in C₅D₅N on a Brucker 400MHz NMR spectrometer.

结构式单晶结构

化合物10：白色条状结晶(甲醇)，易溶于甲醇、乙酸乙酯，微溶于二氯甲烷，难溶于氯仿、石油醚。展开剂：二氯甲烷-甲醇(20∶1，Rf＝0.7)，TLC在UV 254nm下有荧光斑点，以10％硫酸-乙醇溶液为显色剂，加热(115℃)显紫色圆形斑点。¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)中δH5.84(H-17β)，5.39(1H，s，H-17α)；1.31(3H，s)，(3H，s)是甲基上的氢。根据¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)数据可知该化合物含有20个碳，其中δC207.3为一个羰基信号，184.9和85.4显示有一个内酯存在；154.5，116.3为一个环外双键；71.5和65.8提示有二个连氧基团。综合以上数据，推断该化合物可能为一个二萜类化合物。以上光谱数据和文献[16]中的7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯数据基本一致，故鉴定其为7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯，结构式如下；化合物10的碳谱数据与文献中的¹³C-NMR数据见下表4。

表4化合物10与文献的¹³C-NMR数据对比表(δin ppm)

Data^10a were recorded in CD₃OD on a Brucker 150MHz NMR spectrometer.

Data^10b were recorded in CD₃OD on a Brucker 400MHz NMR spectrometer.

结构式

化合物11：白色方晶(甲醇)，易溶于二氯甲烷、甲醇，展开剂：二氯甲烷-甲醇(20∶1)，TLC在波长为254nm下有紫红色荧光点，Rf值约0.8，以10％硫酸-乙醇溶液为显色剂，加热(115℃)显淡粉色圆形斑点。根据¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)中δH1.23(3H，s)，1.19(3H，s)是甲基上的氢。¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)数据可知该化合物含有20个碳，其中δC209.9为一个羰基信号；181.8为一个羧基信号；150.9和115.2为一个环外双键；78.1提示连有一个羟基。综上，推断该化合物可能为一个二萜类化合物。经过X-ray Diffraction Method进行验证了推断，以上光谱数据和文献[17]中的数据基本一致，故鉴定其为9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid，结构式如下；化合物11的碳谱数据与文献中的¹³C-NMR数据见表5。

表5化合物11与文献的¹³C-NMR数据对比表(δin ppm)

Data^11a were recorded in CD₃OD on a Brucker 150MHz NMR spectrometer.

Data^11b were recorded in CD₃OD on a Brucker 600MHz NMR spectrometer.

结构式单晶结构

2.4化合物的理化常数以及波谱数据

7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide：白色条状结晶(吡啶)，难溶于氯仿、石油醚，较易溶于甲醇、乙酸乙酯、吡啶，微溶于二氯甲烷。展开剂：二氯甲烷-甲醇(20∶1)，TLC在UV 254nm下有荧光斑点，10％硫酸-无水乙醇溶液显色：蓝色圆形斑点。¹H-NMR(400MHz，C₅D₅N)δH 6.38(1H，s)，6.03(1H，s，H-17b)，5.75(1H，t，J＝6.1Hz)，5.18(2H，d，J＝13.9Hz，H-17)，4.71(1H，d，J＝6.0Hz)，3.62(1H，s)，3.23(1H，d，J＝6.3Hz)，3.01(1H，dd，J＝9.3，4.5Hz)，2.53(1H，dd，J＝12.1，4.7Hz)，1.12(3H，s，H-20)。¹³C-NMR(101MHz，C₅D₅N)δC36.9(C-1)，19.2(C-2)，28.9(C-3)，42.0(C-4)，51.0(C-5)，85.5(C-6)，81.1(C-7)，62.2(C-8)，73.1(C-9)，46.2(C-10)，43.2(C-11)，30.7(C-12)，36.9(C-13)，34.2(C-14)，202.1(C-15)，156.2(C-16)，113.1(C-17)，26.5(C-18)，183.8(C-19)，22.1(C-20)。其晶体参数如下：分子式为C₂₀H₂₆O₅，晶系为orthorhombic，晶格单位为 α＝90.00°，β＝90.00°，γ＝90.00°，T＝296(2)K，Z＝1等。

5,11β,12β-trihydoroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid：透明针状结晶(甲醇)，化合物难溶于二氯甲烷、氯仿、石油醚，较易溶于甲醇、吡啶。展开剂：二氯甲烷-甲醇(20∶1，Rf＝0.8)，TLC在波长为254nm下有荧光斑点，10％硫酸-无水乙醇显色：淡紫色横条形斑点。¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)δH5.74(1H，s)，5.24(1H，s)，5.13(1H，t，J＝6.2Hz)，4.59(2H，s)，4.18(1H，d，J＝6.0Hz)，3.35(1H，s)，3.04(1H，dd，J＝9.5，4.6Hz)，2.79(1H，d，J＝6.3Hz)，2.27-2.20(1H，m)，2.14-2.06(3H，m)，2.00(1H，dd，J＝14.6，6.0Hz)，1.82(1H，td，J＝12.6，6.5Hz)，1.55(3H，dd，J＝10.7，4.9Hz)，1.38(2H，dd，J＝11.5，5.9Hz)，1.31(3H，s)，1.27-1.21(1H，m)，0.90(3H，s)。¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)δC203.6(C-15)，184.9(C-19)，155.3(C-16)，113.4(C-17)，85.1(C-12)，80.5(C-5)，72.5(C-11)，61.5(C-8)，45.7(C-9)，43.1(C-4)，41.4(C-10)，36.6(C-13)，33.4(C-14)，31.8(C-1)，30.1(C-7)，28.0(C-3)，26.7(C-6)，25.6(C-18)，21.1(C-20)，18.5(C-2).

11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid：透明针状结晶(甲醇)，化合物难溶于二氯甲烷、氯仿、石油醚，较易溶于甲醇、吡啶。展开剂：二氯甲烷-甲醇(20∶1，Rf＝0.7)，TLC在波长为254nm下有紫红色荧光点，10％硫酸-无水乙醇显色：桃红色圆形斑点。¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)δH5.72(1H，s)，5.49(1H，s)，5.24(1H，s)，4.02(1H，d，J＝4.3Hz)，3.03(1H，d，J＝3.5Hz)，2.44(1H，d，J＝11.8Hz)，2.16(1H，d，J＝12.4Hz)，2.09(1H，ddd，J＝14.3，4.7，3.1Hz)，1.97(2H，dd，J＝18.7，2.0Hz，)，1.94(2H，t，J＝4.9Hz)，1.91-1.87(1H，m)，1.86-1.81(2H，m)，1.48-1.43(1H，m)，1.41-1.34(3H，m)，1.23(3H，s)，1.22-1.18(2H，m)，1.14-1.06(2H，m)，0.99(3H，s)。¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)δC212.0(C-15)，181.3(C-19)，152.2(C-16)，112.7(C-17)，66.7(C-11)，63.7(C-9)，57.5(C-5)，52.0(C-8)，44.6(C-4)，41.4(C-12)，40.9(C-1)，40.0(C-10)，39.0(C-3)，38.5(C-13)，37.8(C-7)，35.3(C-14)，29.5(C-18)，21.2(C-6)，20.1(C-2)，16.3(C-20)。其晶体参数如下：分子式为C₂₀H₂₈O₄，晶系为monoclinic，晶格单位为α＝90.00°，β＝104.654°，γ＝90.00°，T＝293(2)K，Z＝2等。

7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯：白色条状结晶(甲醇)，难溶于氯仿、石油醚，易溶于甲醇、乙酸乙酯，微溶于二氯甲烷。展开剂：二氯甲烷-甲醇(20∶1，Rf＝0.7)，TLC在UV 254nm下有荧光斑点，10％硫酸-无水乙醇溶液显色：紫色圆形斑点。¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)δH5.84(1H，s)，5.39(1H，s)，5.28(1H，t，J＝6.0Hz)，4.43(1H，d，J＝6.0Hz)，4.27-4.24(1H，m)，3.35(1H，s)，3.13(1H，dd，J＝9.1，4.8Hz)，2.77(1H，d，J＝11.4Hz)，2.33-2.27(1H，m)，2.10(1H，dt，J＝14.4，5.7Hz)，2.04(1H，dd，J＝11.2，4.9Hz)，1.89(1H，d，J＝6.0Hz)，1.77(1H，dd，J＝7.5，4.3Hz)，1.75(1H，t，J＝5.9Hz)，1.65-1.57(1H，m)，1.54(1H，ddd，J＝11.3，10.1，5.7Hz)，1.45-1.38(1H，m)，1.31(3H，s)，1.29(1H，d，J＝3.3Hz)，1.13(3H，s)，1.12-1.09(1H，m)。¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)δC207.3(C-15)，184.9(C-19)，154.5(C-16)，116.3(C-17)，85.4(C-6)，71.5(C-7)，65.8(C-11)，56.8(C-9)，56.4(C-8)，53.7(C-5)，43.6(C-12)，42.8(C-4)，38.0(C-1)，37.6(C-10)，36.6(C-13)，29.9(C-14)，29.4(C-3)，26.2(C-18)，23.2(C-20)，18.4(C-2)。

9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid：白色方晶(甲醇)，易溶于二氯甲烷、甲醇，展开剂：二氯甲烷-甲醇(20∶1，Rf＝0.8)，TLC在波长为254nm下有紫红色荧光点，10％硫酸-无水乙醇显色：淡粉色圆形斑点。¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)δH5.91(1H，s)，5.32(1H，s)，3.05(1H，s)，2.64(1H，d，J＝12.5Hz)，2.26-2.21(1H，m)，2.18(1H，dd，J＝15.4，6.0Hz)，2.10(1H，d，J＝13.2Hz)，2.00-1.95(1H，m)，1.92(1H，d，J＝9.7Hz)，1.91-1.88(1H，m)，1.88-1.79(1H，m)，1.79-1.76(1H，m)，1.74(1H，dd，J＝14.5，4.3Hz)，1.51-1.47(1H，m)，1.47-1.45(1H，m)，1.45(1H，dd，J＝7.2，2.6Hz)，1.28(1H，dd，J＝14.3，7.2Hz)，1.24-1.19(3H，m)，1.18(3H，d，J＝9.8Hz)，1.12(1H，dt，J＝13.5，3.0Hz)，1.08-0.99(1H，m)。¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)δC210.0(C-15)，181.8(C-19)，151.0(C-16)，115.2(C-17)，78.1(C-9)，58.2(C-8)，50.3(C-5)，46.2(C-10)，44.8(C-4)，38.9(C-3)，38.9(C-13)，38.4(C-1)，35.1(C-7)，32.6(C-14)，30.8(C-12)，30.6(C-11)，29.6(C-18)，21.4(C-6)，20.0(C-2)，17.8(C-20)。其晶体参数如下：分子式为C₂₀H₂₈O₄，晶系为monoclinic，晶格单位为 α＝90.00°，β＝132.624°，γ＝90.00°， T＝173K，Z＝8等。

(二)生物活性研究

1抗肿瘤活性研究考察

采用MTS法对化合物7、8、9、10、11进行人白血病细胞(HL-60)、人肺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(SMMC-7721)、人乳腺癌细胞(MCF-7)和人结肠癌细胞(SW480)的抗肿瘤活性筛选。

1.1实验原理

MTS法：实验原理：MTS为一种全新的MTT类似物，全称为3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTS，生成可溶性的甲臜(Formazan)化合物，甲臜的含量可以用酶标仪在490nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。

1.2实验方法

1.2.1初筛方法

Ⅰ.接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)配成单个细胞悬液，以每孔3000～15000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，细胞提前12～24小时接种培养。

Ⅱ.加入待测化合物溶液：化合物用DMSO溶解，化合物以40μM浓度初筛，每孔终体积200μl，每种处理均设3个复孔。

Ⅲ.显色：37℃培养48小时后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20μl和培养液100μl；悬浮细胞HL-60弃100μl培养上清液，每孔加20μl的MTS溶液；设3个空白复孔(MTS溶液20μl和培养液100μl的混合液)，继续孵育2～4小时，使反应充分进行后测定光吸收值。

Ⅳ.比色：选择492nm波长，多功能酶标仪(MULTISKAN FC)读取各孔光吸收值，记录结果，数据处理后以化合物编号为横坐标，细胞抑制率为纵坐标绘制细胞的抑制率图。

Ⅴ.阳性对照化合物：每次实验均设顺铂(DDP)和紫杉醇(Taxol)两个阳性化合物，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物的IC₅₀值。

1.2.2复筛方法

再对由半数抑制作用的化合物进行复筛，方法Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ与初筛相同，

Ⅱ.加入待测化合物溶液：化合物用DMSO溶解，化合物以40μM、8μM、1.6μM、0.32μM、0.064μM浓度复筛，每孔终体积200μl，每种处理均设3个复孔。

Ⅳ.比色：选择492nm波长，多功能酶标仪(MULTISKAN FC)读取各孔光吸收值，记录结果，数据处理后以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物的IC₅₀值。

1.3抗肿瘤活性筛选结果

1.3.1化合物对人白血病细胞(HL-60)的抑制作用

试验结果表明：在40μM浓度下化合物7、8、9、10、11对人白血病细胞(HL-60)有半数抑制活性，抑制率分别为102.49±0.65、104.41±0.03、52.54±1.45、104.33±0.63、103.98±0.96，实验结果见表6、图1；对白血病HL-60的IC₅₀分别为11.11±0.35、5.452±0.222、36.94±1.86、3.590±0.021、3.523±0.092实验结果见表7、图2；阳性对照化合物细胞生长见图3。

表6受试化合物对人白血病细胞(HL-60)增值影响的结果

表7受试化合物对人白血病细胞(HL-60)的IC₅₀值

1.3.2化合物对人肺癌细胞(A549)的抑制作用

试验结果表明：在40μM浓度下化合物7、8、10、11对人肺癌细胞(A549)有半数抑制活性，抑制率分别为97.89±0.35、98.47±0.12、99.80±0.11、98.84±0.08，实验结果见表8、图4；对人肺癌细胞(A549)的IC₅₀分别为15.69±0.82、15.15±0.22、4.602±0.131、5.429±0.114，实验结果见表9、图5；阳性对照化合物细胞生长见图6。

表8受试化合物对人肺癌细胞(A549)增值影响的结果

表9受试化合物对人肺癌细胞(A549)的IC₅₀值

1.3.3化合物对人肝癌细胞(SMMC-7721)的抑制活性

试验结果表明：在40μM浓度下化合物7、8、9、10、11对人肝癌细胞(SMMC-7721)有半数抑制活性，抑制率分别为96.85±0.47、100.02±0.09、69.63±1.69、99.75±0.16、99.39±0.05，实验结果见表10、图7；对人肝癌细胞(SMMC-7721)的IC₅₀分别为9.541±0.468、7.177±0.515、27.05±0.34、4.005±0.165、4.160±0.066，实验结果见表11、图8；阳性对照化合物细胞生长见图9。

表10受试化合物对人肝癌细胞(SMMC-7721)增值影响的结果

表11受试化合物对人肝癌细胞(SMMC-7721)的IC₅₀值

1.4化合物对人乳腺癌细胞(MCF-7)的抑制活性

试验结果表明：在40μM浓度下化合物7、8、10、11对人乳腺癌细胞(MCF-7)有半数抑制活性，抑制率分别为98.89±0.96、97.99±1.78、97.97±0.16、96.67±1.44，实验结果见表12、图10；对人乳腺癌细胞(MCF-7)的IC₅₀分别为7.111±0.111、5.809±0.097、4.094±0.301、6.091±0.168实验结果见表13、图11；阳性对照化合物细胞生长见图12。

表12受试化合物对人乳腺癌细胞(MCF-7)增值影响的结果

表13受试化合物对人乳腺癌细胞(MCF-7)的IC₅₀值

1.5化合物对人结肠癌细胞SW480的抑制活性

试验结果表明：在40μM浓度下化合物7、8、10、11对人结肠癌细胞(SW480)有半数抑制活性，抑制率分别为91.75±1.47、97.16±0.89、85.88±1.60、93.20±0.80，实验结果见表14、图13；对人结肠癌细胞(SW480)的IC₅₀分别为4.237±0.111，4.662±0.090，1.882±0.168，4.683±0.298实验结果见表15、图14。阳性对照化合物细胞生长见图15。

表14受试化合物对人结肠癌细胞(SW480)增值影响的结果

表15受试化合物对人乳腺癌细胞(SW480)的IC₅₀值

(三)结果

刺齿凤尾蕨的甲醇常温浸提物化学成分，应用¹H-NMR，¹³C-NMR，2D-NMR等相关波谱数据进行解析鉴定，从刺齿凤尾蕨植物中分离得到5个化合物，化合物分别为7β,9-dihydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19,6β-olide(7)、5,11β,12β-trihy-doroxy-15-oxo-ent-kuar-16-en-19-oic acid(8)、11β-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oicacid(9)、7α,11α-二羟基-15-氧-16-亚甲基-对映贝壳杉烷-19,6β-内酯(10)、9-hydroxy-15-oxo-ent-kauran-16-en-19-oic acid(11)。并进行抗肿瘤活性筛选，实验结果表明化合物7、8、10、11对白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7和结肠癌SW480的体外肿瘤生长有半数抑制活性；化合物9对白血病HL-60和肝癌SMMC-7721的体外肿瘤生长有半数抑制活性；化合物7对白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7和结肠癌SW480的体外肿瘤生长半数抑制浓度分别为11.11±0.35、15.69±0.82、9.541±0.468、7.111±0.111、4.237±0.111。化合物8对白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7和结肠癌SW480的体外肿瘤生长半数抑制浓度分别为5.452±0.222、15.15±0.22、7.177±0.515、5.809±0.097、4.662±0.090；化合物9对白血病HL-60体外肿瘤生长半数抑制浓度为36.94±1.86、肝癌SMMC-7721的体外肿瘤生长半数抑制浓度为27.05±0.34；化合物10对白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7和结肠癌SW480的体外肿瘤生长半数抑制浓度分别为3.590±0.021、4.602±0.131、4.005±0.165、4.094±0.301、1.882±0.168；化合物11对白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7和结肠癌SW480的体外肿瘤生长半数抑制浓度分别为3.523±0.092、5.429±0.114、4.160±0.066、6.091±0.168、4.683±0.298。

虽然，上文中已经用一般性说明、

具体实施方式

及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

[1]龚先玲,梁念慈,邓亦峰.半边旗中抗肿瘤成分6F的分离纯化[J].亚太传统医药,2012,8(9):29-30.

[2]张付玉.半边旗和千金子化学成分研究[D].浙江:浙江工业大学,2009:11-17.

[3]Gou ZhanPing,LiangNianCi,HouJie,et al.Two new diterpene andsesquiterpene from Pteris dispar[J].Chinese Chemical Letters,2011,22(12):1451-1453.

[4]KYamasaki,HKohda,TKobayyashi,et al.Application of 13C-nuclearmagnetic resonance speatroscopy to chemistry of glycosides:structures ofpaniculosides-I,-II,-III,-IV and Vditerpene glucosides of Stevia paniculataLag[J].Chem Pharm,1977,25(11):2895-2899.

[5]张晓,李金华,何承伟,等.半边旗中二萜类化合物的植化及抗肿瘤活性初步研究[J].中国药学杂志,1999,34(8):512-514.

[6]T Murakami,H Iida,N Tanaka,et al.Chemische und chemotaxonomis cheUntersuchungen von Filices.XXXIII.Chemische Untersuchungen der Inhaltsstoffevon Pteris longipes Don[J].Chemical&Pharmaceutical Bulletin,1981,29(3):657-662.