光敏分子及包含该光敏分子的表面增强拉曼检测基片的制备方法
技术领域
本发明属于体外诊断技术和拉曼散射光谱检测
技术领域
，具体涉及一种光敏分子及包含该光敏分子的表面增强拉曼(SERS)检测基片的制备方法。背景技术
表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering)，简称SERS，是在普通拉曼散射的基础上发展起来的一种技术。SERS现象通常是指待测物吸附在金属溶胶颗粒(如金、银、铜)或者具有粗糙结构的金属表面，在激发区域内，由于金属表面或近表面的电磁场的增强导致吸附分子的拉曼散射信号与普通拉曼散射相比信号大大增强的一种光学现象。截至目前，SERS检测技术已经在食品安全和环境污染检测等领域得到了广泛的应用。与其他光谱标记技术相比，SERS具有高灵敏度和高特异性、谱峰宽度窄、可多通道检测、信号不受水分子影响等优势，SERS技术被认为在生物医学体外诊断、检测领域具有重大潜在应用，特别是针对通常疾病诊断中微量生物标志物的检测。
临床上抗原、蛋白质的定性和定量分析通常采用免疫学技术，这种方法是基于抗原与抗体的特异性结合。目前常用的免疫学检测方法包括酶联免疫检测法(ELISA)、放射免疫检测法(RIA)、荧光免疫检测法(FIA)等。然而这些方法也各有不足，如放射免疫分析法和荧光免疫分析法虽然检测灵敏度较高，但放射免疫分析法中放射性物质的放射辐射和污染难以避免；荧光免疫法中传统荧光团的发射谱线较宽且易于光降解。常用的酶联免疫吸附试验可以对蛋白质进行低浓度定量分析，但其价格昂贵、操作复杂，且难以实现高通量蛋白质分析。通常疾病体外诊断中所检测生物标志物分子浓度较低，同时血清或尿液样本中组分复杂、干扰成分多，拉曼光谱对特定分子的选择性较差，使得传统SERS传感器的灵敏度和抗干扰性往往达不到要求。将表面拉曼增强技术与免疫检测相结合，拓宽了SERS在体外诊断应用范围。目前采用的“夹心法”是免疫分析中的常用方法，该方法是将特异性抗体标记在载体上，之后加入相应的待测抗原以及标记有特异性抗体和拉曼信号报告分子的金属纳米颗粒，形成“双抗夹心”检测体系，通过检测报告分子的信号实现待测溶液中抗原的检测。
在实际临床诊断中，多种疾病标志物同时检测的需求不断增长，因此高通量集成化检测的重要性日益突显。传统的SERE基底材料的制备包括化学沉积法、电化学沉积法、单分子的自组装等方法，但这类方法往往只能实现均一性能基底材料的制备。目前实现高通量免疫检测的SERS基底的制备方法主要有：电子束、离子束、光刻蚀得到的有序阵列式金属基片；喷墨打印、丝网印刷、3D打印等方法得到的阵列式柔性纸基底；电沉积、离子溅射镀膜法制备的双金属三维有序多孔基底以及表面醛基化预设阵列式固态硅基片等。但是这些基片材料存在结构复杂、表面形貌不可控、工艺复杂、成本昂贵等缺点。而在生物医用材料领域，光图案化技术制得的高通量微阵列或高通量筛选表面已经能够有效筛选多种生物分子库如DNA、蛋白质、抗体等。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于构建光响应软硬基片的光敏分子。
本发明的第二个目的是提供一种基于光图案化技术的表面增强拉曼检测基片的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种利用三明治免疫夹心结构实现抗原等生物标志物的检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一方面提供了一种用于构建光响应软硬基片的光敏分子，结构通式如下所示：R1-X-R2
其中，X为连接基团，选自以下结构的一种：-(CH2)mNHCO(OCH2CH2)nO-、(CH2CH2O)m(CH2)nNHCO(CH2)pO-、-(CH2)mCONH(CH2)nNHCO(CH2)p-、亚烷基(-(CH2)m-)、-(CH2)mO-；
m≥0，n≥0，p≥0；m、n、p均为整数；
R1是可以与软硬基片发生化学键合或自组装的功能基团，选自以下结构的一种：巯基、胺基、CH2＝CHCONH-、CH2＝CHCH3CONH-、丙烯酸酯基、甲基丙烯酸酯基、羧基、含有羟基和/或C1～C6烷基的C4～C18芳基；
R2为可与抗体发生共价键连的光反应基团，选自以下结构中的一种：
Y选自以下结构的一种：-OH、-OCONH(CH2CH2O)pCH3；p为整数；
R3、R4、R5、R6、R7各自独立的选自以下结构的一种：氢、卤素(氟、氯、溴、碘)、C1～C5烷基、C1～C5烷氧基、羟基、巯基、胺基、硝基、氰基。
较优选的，所述的用于构建光响应软硬基片的光敏分子通式中，R1选自以下结构中的一种：
X选择以下结构的一种:
X中，m、n、p均为0-8(包括0和8)的整数；
R2选择以下结构的一种:
p为0-8的整数。
更优选的，所述的光敏分子为以下结构中的一种：
其中，m、n、p均为0-8的整数。
最优选的，所述的光敏分子为以下结构中的一种：
本发明的第二方面提供了一种基于光图案化的表面增强拉曼检测基片的制备方法，包括以下步骤：
所述检测基片包括硬基片和软基片；
所述基于光图案化的表面增强拉曼检测基片的制备方法包括以下步骤：
室温下，将硬基片材料浸泡于0.01-10mM的光敏分子溶液中1～24h，缓慢取出硬基片材料，用体积比为1:1的去离子水和乙腈的混合溶液浸泡冲洗，重复冲洗至少三次，经惰性气体吹干，获得基于光图案化的表面增强拉曼检测硬基片；
或，
所述基于光图案化的表面增强拉曼检测软基片的制备方法包括以下步骤：
将光敏分子1-40mg溶解于0.1-1mL纳米金胶体中，加入其它交联组分10-400mg混合均匀，获得固含为0.1-40％的含有0.1-50mM光敏分子的水凝胶前体溶液；
或，将标记有光敏分子的水溶性大分子1-40mg溶解于0.1-1mL纳米金胶体中混合均匀，获得固含为0.001-10％的光敏分子的水凝胶前体溶液；
向水凝胶前体溶液中加入引发剂或引发助剂并混合均匀，之后将溶液注入到模具中，在惰性气体环境中交联聚合，交联聚合的温度为40～60℃，获得基于光图案化的表面增强拉曼检测软基片。
所述硬基片包括金/镀金基片、银/镀银基片以及金银合金类基片。
所述其它交联组分为丙烯酰胺(AAm)、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、丙烯酸的混合物。
所述标记有光敏分子的水溶性大分子为标记有光敏分子的功能化透明质酸大分子。
所述标记有光敏分子的功能化透明质酸大分子的制备方法包括以下步骤：将摩尔比为1:1:(1～5):(1～5)的光敏分子、丙烯酸酯功能化的透明质酸(HAMA)、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混合，于0℃溶于无水二氯甲烷中，恢复至室温反应，反应结束透析、经冷冻干燥，获得所述标记有光敏分子的功能化透明质酸大分子。
所述丙烯酸酯功能化的透明质酸(HAMA)的制备方法包括以下步骤：
将摩尔比为1:1的透明质酸化合物HA和甲基丙烯酸酐化合物溶于去离子水中，滴加氢氧化钠溶液(4mol/L)使透明质酸体系pH值保持在7～9，于30～50℃条件下反应1～12h，在去离子水中透析、冷冻干燥，获得所述丙烯酸酯功能化的透明质酸(HAMA)。
所述引发剂或引发助剂为过硫酸钾、过硫酸铵、四甲基乙二胺中的至少一种，优选为摩尔比为1:1的过硫酸铵和四甲基乙二胺的混合物。
所述纳米金胶体的制备方法包括以下步骤：
将1g氯金酸HAuCl4溶于超纯水中，于50mL棕色容量瓶中定容，充分摇匀混合后在4℃冰箱内保存；
在250mL三口烧瓶内加入准确量取的98.3mL超纯水，准确量取1mL氯金酸溶液加入到烧瓶中，油浴加热使烧瓶内水溶液产生回流；待观察到冷凝回流管中产生第一滴回流液时，向剧烈搅拌的溶液中加入准确称量好的0.7mL、并提前配制好质量分数为1％的柠檬酸钠水溶液，保持回流状态继续加热，能观察到溶液在2-3min内从灰色变为黑色，最终逐渐稳定成红色溶液，待溶液变成酒红色时，继续回流15min后停止加热，待溶液冷却至室温，转移到棕色试剂瓶中，加入超纯水使溶液恢复至100mL，获得纳米金胶体。
本发明的第三个方面提供了一种利用三明治免疫夹心结构实现生物标志物的检测方法，包括以下步骤：将抗体溶于超纯水配制成抗体溶液；
第一步，将上述制备的基于光图案化的表面增强拉曼检测基片用去离子水润湿表面，将光掩膜版平行固定在基片表面的正上方约0.5mm处，用LED光源照射基片，将光照后的基片浸泡于配置好的抗体溶液中，常温条件下静置浸泡，取出基片，用去离子水清洗表面三次，并用惰性气体轻轻吹干水分，低温保存备用；将该基片浸入0.5％的牛血清白蛋白溶液中进行封端，室温孵育，最终用超纯水冲洗干燥后，得到修饰抗体分子的图案化SERS平面基底；
第二步，光照该金基片的另一区域，根据第一步，在该基片材料上依次程序化在不同区域光照固定其他抗体，重复此操作至所需的全部抗体被固定在相应区域；
第三步，将待测液滴加在或浸没固定有抗体的区域，在潮湿洁净的环境中孵育后，用去离子水轻轻漂洗三次，将标记有抗体、拉曼信号分子修饰的功能性纳米金属颗粒滴加在或浸没该区域，在潮湿洁净环境中孵育后，用去离子水轻轻漂洗三次，用拉曼激光进行光谱测试分析。
所述LED光源的波长根据所选光敏分子的光亲和基团的吸收来确定，可以为250-500nm，优选为300-400nm，光强优选为5-50mW/cm2，进一步优选为10mW/cm2，照射时间1-15分钟，优选为2分钟。
所述抗体为目标检测物的单克隆或多克隆抗体，所述抗体溶液的浓度为1μg/mL-100μg/mL，浸泡时间为0.1-24h，优选6h。
所述抗体具体为鼠抗人C反应蛋白抗体(CPR antibody)、曲霉菌半乳甘露聚糖抗体(EB-A2)、人甲状腺素(T4)抗体、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)特异性单克隆抗体(Anti-CEA)、抗体Anti-AFP(甲胎蛋白)或免疫球蛋白IgM抗体(Anti-IgM)。
所述标记有抗体、拉曼信号分子修饰的功能性纳米金属颗粒的制备方法包括以下步骤：
将浓度为0.1-10mg/mL、体积为1-100μL的拉曼信号分子的DMSO溶液、浓度为0.1-10mg/mL、体积为1-100μL的巯基聚乙二醇3000单甲醚(PEG-SH)的水溶液、浓度为0.1-10mg/mL、体积为1-100μL的聚乙二醇2000单甲醚琥珀酰亚胺酯(PEG-NHS)的DMSO溶液加入到0.1-10mL纳米金胶体中，搅拌反应0.5-8h，离心分离纳米颗粒与溶液，将纳米颗粒重新超声溶解于去离子水中，离心分离，然后将纳米颗粒重新溶于同体积去离子水中，将1μg-10mg抗体加入到上述溶液中并搅拌反应1-24h，通过多次高速离心分离纳米颗粒与溶液，将纳米颗粒重新分散在等体积的去离子水中，在4℃冰箱内保存备用，获得标记有抗体、拉曼信号分子修饰的功能性纳米金属颗粒。
所述拉曼信号分子优选为4-巯基苯甲酸、2-巯基苯甲酸、4-巯基吡啶、对巯基苯胺(PATP)、6-巯基嘌呤(6-MP)。
所述待测液为血液、体液等。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明由于采用光图案化技术使用光敏分子实现检测基片与抗体的共价连接。通过对光照区域精确调控，可实现同一基片材料上多种抗体的标记，从而使得产品满足了多种抗原、蛋白等生物标志物高通量集成化检测的要求。
本发明属于体外诊断技术领域，检测基片的制备包括以下步骤：1)用于构建光响应软硬基片的光敏分子的制备；2)光图案化技术实现基片表面多种抗体的标记；3)金、银纳米颗粒的制备以及抗体和拉曼信号分子的修饰；4)通过三明治免疫夹心结构实现抗原等生物标志物的检测。使用本发明的SERS检测基片可同时实现多种抗原、蛋白等生物标志物的检测，采用2-巯基苯甲酸为拉曼探针分子可使检测极限达10-15mol，使得产品具有较高的灵敏度。利用光图案化技术制备的SERS检测基片具备分辨率高、信号稳定、可高通量检测等优点，在临床体外分析诊断中具有重要的应用价值。
本发明利用表面增强拉曼效应实现抗原免疫检测，其对水敏感度低，因此可适用于水溶液体系如血液、体液等，且在大多情况下不需要样品的制备，能够满足液体活检技术的要求，检测过程具有无创、所需样品量少、操作简便快速等优点。
本发明利用拉曼信号分子以及金属纳米粒子的表面增强拉曼散射效应来进行拉曼信号检测，能够放大拉曼散射信号，极大提高检测分析的灵敏度。
附图说明
图1是实施例11中标记有拉曼信号分子MBA和CPR-antibody的纳米金颗粒透射电镜表征图。
图2是实施例7中制备得到的光响应金基片的XPS(光电子能谱)表征。
图3是实施例11中三明治免疫夹心体系对CPR(10μg/mL)的SERS响应曲线。
图4是实施例11中CPR浓度与拉曼特征峰强度之间关系的标准曲线。
图5是实施例12中CEA浓度与拉曼特征峰强度之间关系的标准曲线。
图6是光图案化的表面增强拉曼检测基片制备方法和应用的流程示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
SNB-1的合成路线：
(1)化合物3的合成与表征：
在50mL圆底烧瓶中，将对硝基氯甲酸苯酯(0.4g，2mmol)用10mL无水DCM溶解。将化合物4(合成方法参照文献：Ming,Z.；Fan,J.；Bao,C.；Xue,Y.；Lin,Q.；Zhu,L.,Photogenerated Aldehydes for Protein Patterns on Hydrogels and Guidance ofCell Behavior.Advanced Functional Materials 2018,28(14).)(0.37g，1mmol)、无水TEA(2mmol，0.3mL)和催化量的DMAP溶于10mL无水DCM中，在氩气保护条件下逐滴滴加到圆底烧瓶中，室温搅拌反应2h后经旋转蒸发仪浓缩溶剂，用flash硅胶柱快速提纯中间产物(100％DCM)。将纯化后的中间产物用20mL无水DMF溶解于50mL圆底烧瓶中，向其中加入三乙胺(2mmol，0.3mL)和胱胺盐酸盐(0.1g，0.4mmol)，氩气保护条件下室温搅拌9h后旋干溶剂，用DCM重溶，水洗有机相三次(50mL)，分离有机相并用无水硫酸钠干燥，经硅胶层析柱提纯(二氯甲烷:甲醇＝100:2)得到化合物3。
化合物3的核磁数据：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ10.23(s,2H),7.81(s,2H),7.08(s,2H),4.31-4.25(m,8H),3.98(s,6H),3.77-3.57(m,24H),3.32(t,J＝4.88Hz,4H),2.79(t,J＝6.28Hz,4H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ182.3,157.9,156.3,155,9,141.3,123.8,111.8,110.9,69.8,69.7,69.5,68.9,63.1,56.2,40.3,36.6.MS(ESI):m/z:Calcd.for C38H54N4O20S2Na+[M+Na]+:973.3Found:973.3.
(2)化合物2的合成与表征：
将化合物3(0.95g，1mmol)溶解于50mL甲醇中，冰浴条件下向其中分批加入NaBH4(76mg，2mmol)，常温搅拌反应1h。用旋转蒸发仪旋干溶剂，加入50mL乙酸乙酯重溶，用1NHCl调节体系pH为中性，水洗有机相3次(50mL)，用无水硫酸钠干燥有机相并旋干溶剂，经硅胶层析柱(二氯甲烷:甲醇＝100:3)提纯得到化合物2。
化合物2的核磁数据：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.78(s,2H),7.02(s,2H),4.61(s,4H),4.28-4.23(m,8H),3.78(s,6H),3.72-3.54(m,24H),3.26(t,J＝4.86Hz,4H),2.78(t,J＝6.29Hz,4H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ156.6,154.9,148.4,140.6,129.1,126.0,110.4,70.2,69.9,69.4,68.8,62.2,58.3,53.6,40.0,36.3.MS(ESI):m/z:Calcd.for C38H58N4O20S2Na+[M+Na]+:977.3Found:977.3.
(3)化合物SNB-1的合成与表征：
准确称取4mg化合物2溶解于2mL乙腈/水(V/V＝1:1)的混合溶液中，称取4.98mg三(2-羧乙基)膦(TCEP)加入至溶液中，用50％NaOH水溶液调节pH至7.2-7.4，将溶液放置于37℃摇床内反应2h。反应完用旋转蒸发仪旋干乙腈，用二氯甲烷(10mL×3)萃取三次，用无水硫酸钠干燥有机相并旋干溶剂，得到化合物SNB-1，于4℃储存备用。
化合物SNB-1的核磁数据：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.57(s,1H),7.12(t,J＝1.1Hz,1H),5.58(t,J＝4.4Hz,1H),4.87(dd,J＝5.9,1.1Hz,2H),4.19(dt,J＝11.9,5.0Hz,4H),4.11(t,J＝5.9Hz,1H),3.80(s,3H),3.76(t,J＝4.9Hz,2H),3.70-3.59(m,10H),3.18(q,J＝4.9Hz,2H),2.59(dt,J＝6.8,4.9Hz,2H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ156.84,151.79,148.45,141.82,133.13,112.62,110.52,70.74,70.62,70.56,70.47,69.86,69.70,68.57,64.04,60.24,56.11,42.16,28.10.MS(ESI):m/z:Calcd.forC19H30N2O10SNa+[M+Na]+:501.1548Found:515.1540.
实施例2
SNB-2的合成路线：
(1)化合物2SNB-2的合成与表征：
在50mL圆底烧瓶中，将对硝基氯甲酸苯酯(0.3g，1.5mmol)用10mL无水二氯甲烷溶解。将化合物2(0.48g，0.5mmol)、无水三乙胺(1.5mmol，0.22mL)和催化量的DMAP溶于10mL无水DCM中，在氩气保护条件下逐滴滴加到圆底烧瓶中，室温搅拌反应2h后经旋转蒸发仪浓缩溶剂，用flash硅胶层析柱快速提纯中间产物(二氯甲烷:乙酸乙酯＝5:1)。将纯化后的中间产物用20mL无水DCM溶解于50mL圆底烧瓶中，向其中加入三乙胺(1.5mmol，0.22mL)和氨基四甘醇单甲醚(0.32g，1.5mmol)，氩气保护条件下室温搅拌过夜反应。反应完毕后，旋干溶剂，水洗有机相三次(50mL)，分离有机相并用无水硫酸钠干燥，经硅胶层析柱提纯(DCM:MeOH＝100:3)得到化合物2SNB-2。
化合物2SNB-2的核磁数据：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.79(s,2H),7.03(s,2H),5.51(s,4H),4.25(m,8H),3.96(s,6H),3.91(t,J＝4.70Hz,4H),3.73-3.52(m,52H),3.49(m,4H),3.42(t,J＝4.91Hz,4H),3.36(s,6H),2.79(t,J＝6.40Hz,4H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ156.41,153.04,147.30,143.26,129.13,122.75,110.17,71.90,70.94,70.67,70.62,70.55,70.47,70.07,69.55,69.49,69.04,63.43,59.00,56.41,51.34,41.51,41.00,39.71.MS(ESI):m/z:Calcd.for C58H96N6O30S2Na+[M+Na]+:1443.5504.Found:1443.5511.
(3)化合物SNB-2的合成
准确称取2SNB-2(4.3mg，0.003mmol)溶解于3mL乙腈/水(V/V＝1:1)的混合溶液中，称取三(2-羧乙基)膦(TCEP)(3.5mg，0.012mmol)加入至溶液中，用50％NaOH水溶液调节pH至7.2-7.4，将溶液放置于37℃摇床内反应2h。反应完用旋转蒸发仪旋干乙腈，用二氯甲烷(10mL×3)萃取三次，用无水硫酸钠干燥有机相并旋干溶剂，得到化合物SNB-2，于4℃储存备用。
化合物SNB-2的核磁数据：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.20(t,J＝1.1Hz,1H),5.58(t,J＝4.4Hz,1H),5.44(d,J＝0.9Hz,2H),5.32(t,J＝5.7Hz,1H),4.19(dt,J＝11.9,5.0Hz,4H),3.88(s,3H),3.76(t,J＝4.9Hz,2H),3.70-3.55(m,24H),3.39-3.31(m,5H),3.18(q,J＝4.9Hz,2H),2.59(dt,J＝6.8,4.9Hz,2H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ156.84,156.57,151.96,148.59,141.56,130.74,112.95,110.49,71.79,70.74,70.62,70.59,70.57,70.56,70.47,69.86,69.70,69.67,69.43,68.57,64.16,64.04,59.02,56.11,42.16,39.25,28.10.MS(ESI):m/z:Calcd.for C29H49N3O15S+[M+H]+:712.3390.Found:712.3423
实施例3
BNBP的合成路线
(1)化合物7的合成
将化合物5(购于上海贤鼎生物科技有限公司)(3.70g，0.01mol)、化合物6(1.98g，0.01mol)以及碳酸钾(2g，0.015mol)加入到250mL单口圆底烧瓶中，加入100mL乙腈，加热回流反应24h。反应结束后，将反应冷却到室温，经抽滤除去不容固体，将滤液减压蒸馏旋干，加入少量二氯甲烷，经硅胶色谱柱(甲醇:二氯甲烷＝1:100)纯化得到化合物7。
化合物7的核磁数据：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.88-7.83(m,2H),7.82-7.77(m,2H),7.58-7.51(m,2H),7.51-7.46(m,1H),7.07-7.01(m,2H),6.50(t,J＝5.1Hz,1H),5.23(t,J＝5.1Hz,1H),4.14(t,J＝5.9Hz,2H),3.63-3.54(m,8H),3.34(dq,J＝5.3,4.3Hz,4H),2.56(t,J＝6.0Hz,2H),1.42(s,9H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ194.43,172.20,163.11,156.42,138.16,132.60,131.77,131.26,130.33,128.75,114.43,79.54,69.96,69.23,69.61,69.43,63.45,40.08,38.53,37.5,28.30.MS(ESI):m/z:Calcd.forC27H37N2O7 +[M+H]+:501.25.Found:501.68.
(2)化合物BNBP的合成
在250mL三口圆底烧瓶中，将化合物7(5.0g，0.01mol)溶解于100mL二氯甲烷:三氟乙酸＝5:1(体积比)的混合溶剂中，常温搅拌反应0.5h后减压旋蒸浓缩溶剂，用硅胶色谱柱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得到化合物BNBP。
化合物BNBP的核磁数据：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.88-7.83(m,2H),7.83-7.77(m,2H),7.58-7.51(m,2H),7.51-7.46(m,1H),7.07-7.01(m,2H),6.50(t,J＝5.1Hz,1H),6.27(d,J＝14.1Hz,2H),4.14(t,J＝5.9Hz,2H),3.65-3.54(m,6H),3.50(t,J＝3.9Hz,2H),3.35(dt,J＝5.1,4.2Hz,2H),2.84(tt,J＝7.0,3.8Hz,2H),2.56(t,J＝6.0Hz,2H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ194.20,172.29,163.78,138.32,132.78,131.60,131.77,130.00,128.75,114.67,72.88,69.93,69.65,69.57,63.80,41.75,40.56,37.14.MS(ESI):m/z:Calcd.for C22H28N2O5Na+[M+Na]+:423.1891.Found:423.1945.
实施例4
DBNP的合成路线:
(1)化合物11的合成与表征：
将化合物9(购于上海贤鼎生物科技有限公司)(0.412g，1mmol)、化合物8(0.162g，1.2mmol)以及碳酸钾(0.414g，3mmol)加入到250mL单口圆底烧瓶中，加入100mL乙腈，加热回流反应24h。反应结束后，将反应冷却到室温，经抽滤除去不容固体，将滤液用减压蒸馏旋干，加入少量二氯甲烷，经硅胶色谱柱(甲醇:二氯甲烷＝1.5:100)纯化得到化合物10。
在250mL三口圆底烧瓶中，将化合物10(0.234g，0.5mmol)溶解于100mL二氯甲烷:三氟乙酸＝5:1的混合溶剂中，常温搅拌反应0.5h后减压旋蒸浓缩溶剂，用硅胶色谱柱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得到化合物11。
化合物11的核磁数据：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.17-7.08(m,1H),6.85-6.79(m,2H),6.28(d,J＝14.1Hz,2H).4.46(s,2H),3.71-3.61(m,8H),3.59-3.38(m,6H),2.90(tt,J＝7.0,3.9Hz,2H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ169.34,155.92,136.22,120.14,116.01,72.74,70.60,70.59,69.53,69.67,69.54,67.20,41.31,39.45.MS(ESI):m/z:Calcd.for C16H25N5O5Na+[M+Na]+:390.17.Found:390.24.
(2)化合物DBNP的合成与表征：
将化合物11(3.67g，0.01mol)溶解于100mL重蒸四氢呋喃中，加入碳酸钾(1.4g，0.015mol)，冰浴条件下缓慢滴加丙烯酰氯(1.2mL，0.015mol)至体系，反应12小时。反应结束后，用2×100mL水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥有机相。减压蒸馏去除溶剂，用硅胶色谱柱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得到化合物DBNP。
化合物DBNP的核磁数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.15(m,2H),7.12-7.09(m,2H),6.85-6.82(m,2H),6.29(t,J＝10.9Hz,1H),6.08(dd,J＝10.9,3.2Hz,1H),5.96(dd,J＝10.8,3.1Hz,1H),4.46(s,2H),3.71-3.62(m,8H),3.59(td,J＝4.4,2.7Hz,4H),3.38(dt,J＝4.9,4.1Hz,2H),3.20(dt,J＝5.9,4.3Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.24,166.89,155.92,136.22,130.21,126.74,121.14,116.87,70.64,70.59,69.68,69.67,69.35,69.47,67.49,39.86,39.26.MS(ESI):m/z:Calcd.for C19H28N5O6 +[M+H]+:422.2035.Found:422.2048.
实施例5
CNPA的合成路线：
(1)化合物14的合成与表征：
将HOBt(0.75g，5.5mmol)、HBTU(2.08g，5.5mmol)用无水DMF(20mL)溶解后加入化合物13(0.92g，5mmol)，然后加入化合物12(0.97g，6mmol)，在室温下搅拌6h，然后用水淬灭，乙酸乙酯萃取。有机层用饱和食盐水洗2次，然后用MgSO4干燥。用硅胶色谱柱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:4)得到化合物14。
化合物14的核磁数据：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.30(s,1H),7.08(t,J＝5.1Hz,1H),6.70(m,2H),6.57(m,J＝8.8,2.0,0.9Hz,1H),6.24(s,1H),5.26(t,J＝5.1Hz,1H),3.47(dt,J＝5.3,4.4Hz,2H),3.30(m,2H),2.74(tt,J＝8.2,1.1Hz,2H),2.45(s,1H),2.45(d,J＝16.5Hz,1H),1.42(s,9H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ173.47,156.41,145.34,144.35,132.79,121.01,116.04,115.34,79.54,40.09,39.25,37.29,29.10,28.10.MS(ESI):m/z:Calcd.for C16H24N2O5Na+[M+Na]+:347.16.Found:347.24.
(2)化合物15的合成与表征：
在250mL三口圆底烧瓶中，将化合物14(0.648g，2mmol)溶解于100mL二氯甲烷:三氟乙酸＝5:1的混合溶剂中，常温搅拌反应1h后减压旋蒸浓缩溶剂，用硅胶色谱柱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得到化合物15。
化合物15的核磁数据：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.30(s,1H),7.09(t,J＝4.9Hz,1H),6.72(m,2H),6.43(ddt,J＝8.8,2.0,0.9Hz,1H),6.10(s,1H),4.08(t,J＝6.3Hz,2H),3.24(dt,J＝4.9,4.2Hz,2H),3.01(tt,J＝6.4,4.3Hz,2H),2.78(tt,J＝8.2,1.1Hz,2H),2.24(t,J＝8.2Hz,2H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ174.67,145.29,144.35,132.79,121.14,116.04,115.34,40.81,40.12,37.78,30.02.MS(ESI):m/z:Calcd.for C11H16N2O3Na+[M+Na]+:247.11.Found:247.30.
(3)化合物17的合成与表征：
将乙酰丙酸即化合物16(2g，0.017mol)装入圆底烧瓶并在氮气下冷却至0℃，缓慢地将7N NH3(溶于5mL甲醇中)加入烧瓶内。3小时后，逐滴滴加5mL羟胺磺酸(3.2g，0.03mol)的无水甲醇溶液于烧瓶内，滴加完毕后将所得溶液恢复至室温并过夜反应。将反应溶液在真空条件下浓缩，并将浓缩物重悬于无水甲醇中。通过过滤除去体系中白色沉淀，将滤液通过减压浓缩，再次于无水甲醇50mL中溶解。在0℃条件下，添加三乙胺(4.3mL)和碘(2.1g，0.008mol)的无水甲醇溶液10mL至溶液呈深棕色并保持10min不变色，表明二氮杂环丙烷中间体氧化完成。用乙酸乙酯稀释溶液，并用1N盐酸和硫代硫酸钠的饱和水溶液多次洗涤。将体系分液并将有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩溶剂后经硅胶层析柱提纯得到化合物17。
化合物17的核磁数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm)，10.44(s,1H,2.30(m,2H,1.85(m,J＝6.4Hz,2H),1.11(s,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d),δ(ppm):178.56,28.73,28.03,24.75,19.74.MS(ESI):m/z:Calcd.for C5H9N2O2 +[M+H]+:129.07.Found:129.10.
(4)化合物CNPA的合成与表征：
将HOBt(0.75g，5.5mmol)、HBTU(2.08g，5.5mmol)用无水DMF(20mL)溶解后加入化合物17(0.64g，5mmol)，然后加入化合物15(1.35g，6mmol)，在室温下搅拌6h，然后用水淬灭，乙酸乙酯萃取。有机层用饱和食盐水洗2次，然后用MgSO4干燥。用硅胶色谱柱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:4)得到化合物CNPA。
化合物CNPA的核磁数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.11-7.05(m,1H),6.98-6.92(m,1H),6.75-6.68(m,2H),6.57(ddt,J＝8.8,2.0,0.9Hz,1H),6.24(s,1H),3.33-3.25(m,4H),2.78(tt,J＝8.2,1.1Hz,2H),2.51-2.42(m,4H),2.11-2.01(m,2H),1.49(s,3H).
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ173.84,145.29,144.35,132.79,121.01,116.04,115.34,74.75,49.34,48.83,39.82,37.29,36.06,29.98,24.57,22.83.
MS(ESI):m/z:Calcd.，for C16H22N4O4Na+[M+Na]+:357.1534.Found:357.1560.
实施例6
纳米金胶体的制备：
将1g氯金酸HAuCl4溶于超纯水中，于50mL棕色容量瓶中定容，充分摇匀混合后在4℃冰箱内保存。在250mL三口烧瓶内加入准确量取的98.3mL超纯水，准确量取1mL氯金酸溶液加入到烧瓶中，油浴加热使烧瓶内水溶液产生回流。待观察到冷凝回流管中产生第一滴回流液时，向剧烈搅拌的溶液中加入准确称量好的0.7mL、并提前配制好质量分数为1％的柠檬酸钠水溶液。保持回流状态继续加热，能观察到溶液在2-3min内从灰色变为黑色，最终逐渐稳定成红色溶液。待溶液变成酒红色时，继续回流15min后停止加热，待溶液冷却至室温，转移到棕色试剂瓶中，加入超纯水使溶液恢复至100mL，获得纳米金胶体。
实施例7
一种可实现多种抗体标记的光响应硬基片的制备方法，如图6所示，图6是光图案化的表面增强拉曼检测基片制备方法和应用的流程示意图，包括以下步骤：
实施例2制备的光敏分子SNB-2在金基片上的修饰是通过巯基金自发形成自组装单分子层。具体步骤如下：室温下，取出洁净的金基片(尺寸1cm×3cm)浸泡于浓度为1mM的SNB-2溶液20mL中，在室温下浸泡12h。缓慢的从SNB-2溶液中匀速取出金基片，保证刚刚露出液面的部分呈洁净状态。待将全部基片提取出SNB-2溶液，用去离子水和乙腈(1:1)的混合溶液轻轻浸泡冲洗金基片，反复冲洗三次，惰性气体吹干，得到了可实现多种抗体标记的光响应硬基片即表面修饰的功能分子SNB-2的金基片。
图2是实施例7中制备得到的光响应金基片的XPS(光电子能谱)表征。如图2中所示，在洁净的金基片Au表面出现金元素特征能带，分别为Au4f(84eV，85eV)，Au4d(334eV，353eV)，Au4p(546eV)，以及相对强度较低的C1s(248eV)和O1s(532eV)。经过光响应分子修饰后，XPS能谱图中Au的信号明显降低，相对地，C1s(248eV)和O1s(532eV)的信号增强，并在400eV出现新的N1s信号，证明光响应分子成功修饰在金基片表面。
实施例8
一种可实现多种抗体标记的光响应硬基片的制备方法，包括以下步骤：
取出洁净的银基片(尺寸1cm×3cm)浸泡于浓度为1mM的实施例1所制得的SNB-1溶液20mL中，在室温下浸泡12h。缓慢的从SNB-1溶液中匀速取出银基片，保证刚刚露出液面的部分呈洁净状态。待将全部基片从SNB-1溶液中取出后，用去离子水和乙腈(1:1)的混合溶液轻轻浸泡冲洗银基片，反复冲洗三次，惰性气体吹干，得到了可实现多种抗体标记的光响应硬基片即表面修饰的功能分子SNB-1的银基片。
实施例9
一种可实现多种抗体标记的光响应软基片的制备方法，包括以下步骤：
第一步，标记有光敏分子BNBP的功能化透明质酸大分子(HA-BNBP)的制备方法，包括以下步骤：
丙烯酸酯功能化的透明质酸(HA-MA)的制备方法包括以下步骤：将1g透明质酸化合物HA(购于华熙生物科技有限公司、分子量7.4万、化妆品级)溶于100mL去离子水中，将11.5mL甲基丙烯酸酐加入到该溶液中，透明质酸化合物HA和甲基丙烯酸酐化合物的摩尔比为1:1，并滴加4mol/L氢氧化钠溶液使透明质酸体系pH值保持在8左右，于40℃条件下反应6h。将反应液经透析袋(KDa3500)在去离子水中透析3天，用冷冻干燥技术除去溶剂得到HA-MA。δ＝5.6和6.1ppm处的丙烯酸酯上的双键核磁特征峰，以δ＝1.8-2.0ppm N-乙酰氨基上甲基氢的积分为标准，通过积分面积对比，得到透明质酸上甲基丙烯酸酯的标记率为60.4％。
将实施例3制备的BNBP(0.4g，0.001mol)、上述制备的丙烯酸酯功能化的透明质酸(HA-MA)(0.3g)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.34g，0.003mol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.57g，0.003mol)于0℃溶于10mL无水二氯甲烷中，光敏分子、丙烯酸酯功能化的透明质酸(HAMA)、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1:3:3，恢复至室温反应6h。反应结束后将体系用透析袋(KDa3500)透析3天后经冷冻干燥得到HA-BNBP。以δ＝7.85-6.50ppm范围内的苯环上氢的核磁特征峰、以δ＝1.8-2.0ppm N-乙酰氨基上甲基氢的积分为标准，通过面积对比，得到BNBP的标记率为3.5％。
第二步，含有光敏分子BNBP的丙烯酸功能化透明质酸大分子(HA-BNBP)水凝胶基片的制备方法包括以下步骤：
取20mg第一步制备的HA-BNBP溶于1mL纳米金胶体(实施例6制备)溶液中制备成固含量为2％的水凝胶前体溶液，向该溶液中加入50μL的2mol/L过硫酸铵水溶液和50μL的2mol/L四甲基乙二胺水溶液，涡旋至混合均匀，将该前体溶液缓慢加入基片模具(长方体形状的聚四氟乙烯基片模具，前体溶液会变成固体基片)中，惰性气体保护条件下，加热至50℃引发交联(过硫酸铵为热引发剂，加热，聚合成固体即聚合完成)制得含有光敏分子BNBP的功能化透明质酸大分子(HA-BNBP)水凝胶基片。
实施例10
一种可实现多种抗体标记的光响应软基片的制备方法，包括以下步骤：
第一步，将实施例4制备的光敏分子DBNP 20mg溶解于0.5mL实施例6制备的纳米金胶体中，随后加入丙烯酰胺20mg、丙烯酸20mg、N,N-亚甲基双丙烯酰胺2mg混合均匀，获得固含为12.5％的水凝胶前体溶液。
第二步，向第一步制备的水凝胶前体溶液中加入50μL的2mol/L过硫酸铵水溶液和50μL的2mol/L四甲基乙二胺水溶液，涡旋至混合均匀，将该前体溶液缓慢加入基片模具，在惰性气体保护条件下，加热至50℃引发交联，制得含有光敏分子DBNP的光响应软基片。
实施例11
一种基于光敏分子SNB-2的光响应金基片实现多种抗原免疫检测方法，包括以下步骤：
基本原理：利用待测抗原与基片表面所固定抗体之间的免疫复合反应，实现在待测抗原基片表面的固定，再利用待测抗原与金属纳米颗粒表面所修饰的抗体之间的免疫复合反应，使金属纳米颗粒被固定在基片表面，形成基片抗体-抗原-抗体金属纳米颗粒的三明治夹心结构，通过检测金属纳米颗粒修饰的拉曼标记分子的拉曼光谱来检测特定抗原。多种抗原检测是利用基片表面的光敏分子的光响应反应特性，实现同一基片材料不同区域上多种抗体标记。其具体包括如下步骤：
用去离子水润湿实施例7所制得表面修饰的功能分子SNB-2的金基片表面，在上方约0.5mm处平行固定光掩模板(光照区域大小为2mm×2mm)，经光强为10mW/cm2，波长为365nm的LED光源照射2min后，将该金基片浸泡于浓度为100μg/mL的鼠抗人C反应蛋白抗体(CPR-antibody)溶液中，常温条件下静置6h，取出金基片，用去离子水清洗三次。并用惰性气体轻轻吹干水分，低温保存备用。
将该基片浸入0.5％的牛血清白蛋白溶液中进行封端，室温孵育3h，最终用超纯水冲洗干燥后，得到修饰抗体分子的图案化SERS平面基底。然后光照该金基片的另一区域，重复上述操作，进行第二种抗体曲霉菌半乳甘露聚糖抗体(EB-A2)的标记，经多次重复操作实现了同一基片上CPR-antibody、EB-A2、Anti-CEA、Anti-IgM四种抗体的标记。
取待测液15μL滴加到固定有抗体的区域，在潮湿洁净的环境中孵育1h，用去离子水轻轻漂洗三次。将制备好的浓度为20μg/mL分别标记有CPR-antibody、EB-A2、Anti-CEA或Anti-IgM和拉曼报告分子MBA的AuNP溶液各10μL滴加在相应区域，在潮湿洁净环境中孵育3h，用去离子水轻轻漂洗三次。将制备好的表面增强拉曼三明治夹心金基片用惰性气体干燥，进行拉曼光谱测试。
图3是实施例11中三明治免疫夹心体系对CPR(10μg/mL)的SERS响应曲线。从图中可以看出，在633nm波长的激光激发下，在SERS夹心免疫应答的区域呈现归属为MBA的C＝C环呼吸振动模式的两个明显的拉曼信号峰，分别位于1075cm-1和1585cm-1处。而对于没有加入SERS探针的基片，即抗体修饰的捕获基片(capture substrate)和捕获CPR后的基片(capture substrate+CPR)，在相同测试条件下，光照区域几乎检测不到拉曼信号。在此基础上，进一步对不同浓度的CPR进行了拉曼信号测试，图4是实施例11中CPR浓度与拉曼特征峰强度之间关系。从图4中可以看出，信号分子MBA的拉曼信号强度随着待测液中CPR浓度的增加而增加，从而可以通过信号强度反向推断所测CPR的浓度。
标记有抗体、拉曼信号分子修饰的功能性纳米金属颗粒的制备方法包括以下步骤：
准确配制2mM拉曼信号分子2-巯基苯甲酸(MBA)的DMSO溶液，1mM的聚乙二醇2000单甲醚琥珀酰亚胺酯(PEG-NHS)的DMSO溶液，以及1mM的巯基聚乙二醇3000单甲醚(PEG-SH)的水溶液。
在高速搅拌条件下，向每毫升纳米金胶体(实施例6制备的纳米金胶体，浓度5.886×10-7mM)中加入5μL MBA溶液与5μL PEG-NHS溶液，搅拌反应1h后向每毫升纳米金胶体中加入50μL PEG-SH溶液，继续搅拌反应5h。反应结束后在8000rpm/min的离心机中离心10min，弃去上清液，将沉淀的胶体金重新超声溶解于去离子水中，在7000rpm/min的离心机中离心10min，弃去上清液，重复离心一次，将胶体金超声溶于同体积去离子水中得到聚乙二醇包裹修饰的纳米金颗粒(AuNP-PEG)。在快速搅拌条件下，将配制好的浓度为20μg/mL的抗体Anti-AFP(甲胎蛋白)溶液20μL加入到上述溶液中，搅拌反应12h后经7000rpm/min的离心机中离心10min，弃去上清液，重复操作三次，将纳米金超声重新分散在等体积的去离子水中，在4℃冰箱内保存备用，获得聚乙二醇包裹修饰后的纳米金颗粒，如图1中f-AuNP结构所示，图1是实施例11中标记有拉曼信号分子MBA和CPR-antibody的纳米金颗粒透射电镜表征图。对该功能化纳米颗粒进行了紫外和粒径表征，如图1中左下方为其紫外-可见光吸收谱图，f-AuNP在500-600nm出现吸收峰并在542nm处出现最大吸收值，说明成功制备了球形纳米颗粒，插图为对应DLS表征，数据显示修饰有抗体的纳米金颗粒的平均水合粒径为73.2nm。
同上操作步骤，分别制得鼠抗人C反应蛋白抗体(CPR antibody)、曲霉菌半乳甘露聚糖抗体(EB-A2)、人甲状腺素(T4)抗体、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)特异性单克隆抗体(Anti-CEA)或免疫球蛋白IgM抗体(Anti-IgM)和拉曼信号分子MBA标记的纳米金颗粒。
实施例12
一种基于光敏分子BNBP的光响应水凝胶基片实现多种抗原免疫检测方法。多种抗原免疫检测原理同实施例9，具体包括如下步骤：
用超纯水润湿实施例8所制得表面修饰的功能分子SNB-1的银基片表面，在上方约0.5mm处平行固定光掩模板(光照区域大小为2mm×2mm)，经光强为10mW/cm2，波长为365nm的LED光源照射2min后，将该水凝胶浸泡于浓度20μg/mL的Anti-AFP溶液中，常温条件下静置6h，用去离子水清洗三次。然后光照水凝胶另一区域，重复上述操作，进行第二种抗体Anti-CEA的标记，重复操作实现同一基片上Anti-AFP、CPR-antibody、EB-A2、Anti-CEA、Anti-IgM四种抗体的标记。
取待测液15μL滴加到固定有抗体的区域，在潮湿洁净的环境中孵育1h，用去离子水轻轻漂洗三次。将制备好的分别标记有抗体Anti-AFP、CPR-antibody、EB-A2、Anti-CEA、Anti-IgM以及拉曼报告分子MBA的五种AuNP溶液各10μL滴加在相应区域，在潮湿洁净环境中孵育3h，用去离子水轻轻漂洗三次。将制备好的表面增强拉曼三明治夹心检测水凝胶基片用惰性气体干燥，进行拉曼光谱测试。
图5是实施例12中CEA浓度与拉曼特征峰强度之间的关系。从图中可以看出，信号分子MBA的拉曼信号强度随着待测液中CEA浓度的增加而增加，检测区域覆盖了临床检测范围，可支持常规低浓度CEA检测，也证明了检测基片对多种抗体的通用性。
对比例1
图章印刷技术制备SERS硬基片用于蛋白质的检测：
镀金硅片经乙醇冲洗和钝性气体干燥。将一个具有直径为3mm圆孔的聚二甲基硅氧烷(PDMS)图章薄膜浸入在2mM的十八硫醇溶液中1min，并在高纯氮气流下进行干燥。将干燥的PDMS印压在镀金硅片表面30s，使镀金硅片表面留下一个3mm的未覆盖区域。将该基片浸入到0.1mM二硫代丁二酰丙酸酯(DSP)的乙醇溶液中浸泡16h，用乙醇冲洗并用惰性气体干燥，形成3mm的DSP圆形涂层。将20μL浓度20μg/mL的Anti-CEA抗体滴加到DSP涂层区域，在潮湿环境中反应8h，抗体通过蛋白质上的氨基与DSP的琥珀酰亚胺酯形成的酰胺键连接到DSP层。用10mM PBS冲洗基片，暴露于20μL阻断缓冲液中16h。将待测物20μL暴露在测试区域8h，经过冲洗后将测试区暴露在功能性标记anti-CEA和MBA拉曼信号分子的纳米金胶体中16h，形成双抗夹心结构，经过冲洗并干燥后进行拉曼分析测试。
该方法可以形成特定规则的蛋白质检测区域，实现单一待测物的浓度检测，但操作过程复杂，规则区域难以进行进一步精确控制。而本发明利用简单光照即可实现可控图案化多种、多次检测区域的制备，可以实现微米级待测区的制备且能够在同一个基底材料进行多种待测物的检测。
对比例2
SERS软基片用于蛋白质的检测：
将氟代四甘醇配体包裹的金胶体浇铸在食人鱼溶液清洁过的氧化硅基片上，溶剂蒸发后形成一层蓝色薄膜。将2M丙烯酸单体、10mM四甘醇二丙烯酸酯交联剂与8mM的2-酮戊二酸引发剂组成的前体水液倒入模具保护的金薄膜上，365nm光照聚合3h。将聚合水凝胶轻轻取下，金薄膜转移至水凝胶表面。通过改变水凝胶环境的盐浓度(1-0.001M)，水凝胶表现出盐响应收缩与溶胀。该水凝胶用于细胞色素C与结晶紫的检测中，在1M NaCl环境中由于水凝胶收缩导致纳米颗粒距离变小产生的表面共振效应，能够明显检测出待测物的高达约30000counts的信号峰。
该检测方法能够明显体现出待测物本身的拉曼信号峰，实现待测物结构的鉴定，但检测环境盐浓度高，不利于许多生物分子的检测，且虽然能够实现多种待测物的同时鉴定，但待测物种类的增多导致信号峰难以分辨，不利于待测物的分析。而本发明设计的检测方法可以将同一待测溶液中的不同物质固定在特定的区域而不相互干扰，更利于多种待测物质的同时量化分析。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
