2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物、制备方法及应用。
背景技术
牛樟芝含有丰富的活性代谢产物，包括三萜类化合物(Triterpenoids)、马来酸和琥珀酸衍生物(Maleic acid and succinic acid derivatives)、多糖(Polysaccharides)、泛醌类衍生物(Ubiquinone derivatives)、甾醇类(Steroids)、核酸类(Nucleic acids)等，具有抗炎、抗癌、保护肝脏、抗氧化、增强免疫力等多种活性。
牛樟芝固态发酵产物中已经分离得到多种泛醌类衍生物，具有良好的抗炎和抗癌活性。牛樟芝固态发酵主要是以谷物为原料进行培养，培养周期及较长(30d左右)，且由于固态发酵方式的限制，并不能良好的实现发酵过程控制和大规模生产。但是常规的牛樟芝液态发酵产物中基本上不含有泛醌类活性成分，这就使得牛樟芝液态发酵产品的附加值大大降低。
目前利用对羟基苯甲酸和辅酶Q0等化合物可以诱导牛樟芝在液态发酵过程中合成泛醌类组分，然而诱导产量较低，且这两种化合物对牛樟芝菌体生长有一定抑制作用。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物、制备方法及应用。
本发明提供了一种2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物，具有这样的特征：该化合物的结构式如下：
本发明还提供了一种2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物的制备方法，具有这样的特征，包括如下步骤：步骤1，将2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌加入甲醇中搅拌至溶清，而后将溶解完全的甲醇溶液在冰浴下缓慢加入硼氢化钠，并在设定的温度下搅拌6h～12h，得到混合物；步骤2，向混合物中加入水进行淬灭反应，待浓缩80％(v/v)甲醇后，采用二氯甲烷进行萃取，而后进行浓缩以得到有机相，最后对该有机相进行柱层析，得到2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物，其中，步骤1中，硼氢化钠与2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的摩尔比为(1～5):1。
本发明还提供的2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤1中，搅拌的预定时间为10h。
本发明还提供的2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤1中，硼氢化钠与2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的摩尔比为3:1。
本发明还提供的2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤2中，采用硅胶柱层析，且洗脱剂采用体积比为3:1～1:1的石油醚:乙酸乙酯。
本发明还提供了2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物在诱导牛樟芝泛醌类活性成分中的应用。
发明的作用与效果
本发明的2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物的制备方法简单、成本低、产率高、容易实现工业化生产。另外，本发明的2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物作为前体物，能够高效的诱导牛樟芝合成泛醌类活性成分，其诱导效果要高于已报到的辅酶Q0，极大的提高了牛樟芝泛醌类活性成分的产量。并且，2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物的添加对牛樟芝菌体生长没有抑制作用。
附图说明
图1是本发明的实施例中牛樟芝菌株S-29液态发酵产物的HPLC图谱。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。
本发明提供了一种2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物，该化合物的结构式如下：
本发明还提供了一种2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1，将2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌加入甲醇中搅拌至溶清，而后将溶解完全的甲醇溶液在冰浴下缓慢加入硼氢化钠，并在设定的温度下搅拌6h～12h，得到混合物。
步骤1中，硼氢化钠与2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的摩尔比为(1～5):1。
优选的，硼氢化钠与2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的摩尔比为3:1，搅拌的预定时间为10h。
步骤2，向所述混合物中加入水进行淬灭反应，待浓缩80％(v/v)甲醇后，采用二氯甲烷进行萃取，而后进行浓缩以得到有机相，最后对该有机相进行柱层析，得到2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物。
步骤2中，采用硅胶柱层析，且洗脱剂采用体积比为3:1～1:1的石油醚:乙酸乙酯。
本发明还提供了2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物在诱导牛樟芝泛醌类活性成分中的应用，
具体地，在进行应用时有如下两种方法：
方法1：将2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物作为诱导剂加入牛樟芝液态发酵中，在通风及搅拌条件下，能够有效诱导出牛樟芝泛醌类活性成分，并且对牛樟芝菌体生长没有显著的抑制作用。
方法2：将2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物作为诱导剂加入牛樟芝液态发酵中，加入溶剂，在通风及搅拌条件下，能够有效诱导出牛樟芝泛醌类活性成分，泛醌类活性成分高度富集浓缩在溶剂石蜡油中，且对牛樟芝菌体生长没有显著的抑制作用。
进一步地，方法2中溶剂为石蜡油、长链烷烃(C12-C16)、亚麻籽油以及亚油酸的任意一种或任意两种以上的混合物。
进一步地，应用的采用的均是牛樟芝菌株(Antrodia camphorata)S-29，该菌株于已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9590，保藏时间为2014年09月09日。
下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
斜面培养基(g/L)：黄豆浆60mL/L，葡萄糖40，磷酸二氢钾0.5，七水硫酸镁0.5，柠檬酸0.5，pH 5；115℃，灭菌20min。
种子液培养基(g/L)：玉米浆4，葡萄糖20，磷酸二氢钾0.5，七水硫酸镁0.5，柠檬酸0.5，pH 5.5；115℃，灭菌20min。
发酵液培养基(g/L)：玉米浆8，葡萄糖60，磷酸二氢钾0.5，七水硫酸镁0.5，柠檬酸0.5，pH 5.5；115℃，灭菌20min。
实施例1：
步骤1，将2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌1.822g(10mmol)溶解于100mL甲醇中搅拌至全部溶解，将溶解完全的甲醇溶液放置在冰浴条件下，缓慢加入硼氢化钠0.378g(10mmol)，硼氢化钠与2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌摩尔比为1:1，20℃搅拌6h，得到混合物。
步骤2，向混合物中加入水进行淬灭反应，待浓缩80％(v/v)甲醇后，采用二氯甲烷进行萃取，而后进行浓缩以得到有机相，最后采用硅胶柱层析对该有机相进行纯化，得到2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物1.166g，产率64％。其中，洗脱剂采用体积比为3:1～1:1的石油醚:乙酸乙酯。
实施例2：
步骤1，将2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌1.822g(10mmol)溶解于100mL甲醇中搅拌至溶清，将溶解完全的甲醇溶液放置在冰浴条件下，缓慢加入硼氢化钠1.135g(30mmol)，硼氢化钠与2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌摩尔比为3:1，20℃搅拌10h，得到混合物。
步骤2，向混合物中加入水进行淬灭反应，待浓缩80％(v/v)甲醇后，采用二氯甲烷进行萃取，而后进行浓缩以得到有机相，最后采用硅胶柱层析对该有机相进行纯化，得到2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物1.601g，产率88％。其中，洗脱剂采用体积比为3:1～1:1的石油醚:乙酸乙酯。
实施例3：
步骤1，将2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌1.822g(10mmol)溶解于100mL甲醇中搅拌至溶清，将溶解完全的甲醇溶液放置在冰浴条件下，缓慢加入硼氢化钠1.892g(50mmol)，硼氢化钠与2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌摩尔比为5:1，20℃搅拌12h，得到混合物。
步骤2，向混合物中加入水进行淬灭反应，待浓缩80％(v/v)甲醇后，采用二氯甲烷进行萃取，而后进行浓缩以得到有机相，最后采用硅胶柱层析对该有机相进行纯化，得到2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物1.257g，产率69％。其中，洗脱剂采用体积比为3:1～1:1的石油醚:乙酸乙酯。
图1是本发明的实施例中牛樟芝菌株S-29液态发酵产物的HPLC图谱，图1(A)为实施例4的发酵空白对照实验HPLC图谱，图1(B)为实施例5的辅酶Q0诱导实验HPLC图谱，图1(C)为实施例6的2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物诱导实验HPLC图谱，图中，横坐标表示保留时间，纵坐标表示UV254nm吸收响应值。
实施例4：牛樟芝菌株S-29发酵空白对照实验
将牛樟芝菌株S-29制备种子液，按照15％接种量将种子液接入发酵培养基中，培养温度28℃，转速150r/min，培养时间10d，通气量1.2v/(v.m)。发酵结束后，收集菌体，测定菌体量以及泛醌类活性成分含量。
在此条件下，牛樟芝菌株S-29的发酵菌体量为13.55g/L。牛樟芝菌体中不含有泛醌类活性成分。
实施例5：化合物辅酶Q0对牛樟芝泛醌类活性成分的诱导作用
将牛樟芝菌株S-29制备种子液，按照15％接种量将种子液接入发酵培养基中，培养温度28℃，转速150r/min，通气量1.2v/(v.m)。在发酵第3d，向发酵液中加入0.3g/L的辅酶Q0，继续发酵7d。发酵结束后，收集菌体，测定菌体量以及泛醌类活性成分含量。
在此条件下，牛樟芝菌株S-29发酵菌体量为8.74g/L。牛樟芝菌体中诱导出泛醌类活性成分，其中，Antroquinonol含量达到35.77mg/L。
实施例6：2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物对牛樟芝泛醌类活性成分的诱导作用
将牛樟芝菌株S-29制备种子液，按照15％接种量将种子液接入发酵培养基中，培养温度28℃，转速150r/min，通气量1.2v/(v.m)。在发酵第3d，向发酵液中加入0.3g/L的2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物，继续发酵7d。发酵结束后，收集菌体，测定菌体量以及泛醌类活性成分含量。
在此条件下，牛樟芝菌株S-29发酵菌体量为13.84g/L。牛樟芝菌体中诱导出泛醌类活性成分，其中，Antroquinonol含量达到58.27mg/L。
实施例7：石蜡油溶剂存在下，辅酶Q0对牛樟芝泛醌类活性成分的诱导作用
将牛樟芝菌株S-29制备种子液，按照15％接种量将种子液接入发酵培养基中，培养温度28℃，转速150r/min，通气量1.2v/(v.m)。在发酵第3d，向发酵液中加入0.3g/L的辅酶Q0和20％(v/v)石蜡油，继续发酵7d。发酵结束后，收集菌体，测定菌体量以及泛醌类活性成分含量。
在此条件下，牛樟芝菌株S-29发酵菌体量为10.26g/L。牛樟芝菌体中诱导出泛醌类活性成分，其中，Antroquinonol含量达到135.82mg/L。
实施例8：石蜡油溶剂存在下，对羟基苯甲酸对牛樟芝泛醌类活性成分的诱导作用
将牛樟芝菌株S-29制备种子液，按照15％接种量将种子液接入发酵培养基中，培养温度28℃，转速150r/min，通气量1.2v/(v.m)。在发酵第3d，向发酵液中加入0.3g/L的对羟基苯甲酸和20％(v/v)石蜡油，继续发酵7d。发酵结束后，收集菌体，测定菌体量以及泛醌类活性成分含量。
在此条件下，牛樟芝菌株S-29发酵菌体量为11.36g/L。牛樟芝菌体中诱导出泛醌类活性成分，其中，Antroquinonol含量达到73.16mg/L。
实施例9：石蜡油溶剂存在下，2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物对牛樟芝泛醌类活性成分的诱导作用
将牛樟芝菌株S-29制备种子液，按照15％接种量将种子液接入发酵培养基中，培养温度28℃，转速150r/min，通气量1.2v/(v.m)。在发酵第3d，向发酵液中加入0.3g/L的2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物和20％(v/v)石蜡油，继续发酵7d。发酵结束后，收集菌体，测定菌体量以及泛醌类活性成分含量。
在此条件下，牛樟芝菌株S-29发酵菌体量为13.13g/L。牛樟芝菌体中诱导出泛醌类活性成分，其中，Antroquinonol含量达到238.57mg/L。
实施例10：亚麻籽油溶剂存在下，2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物对牛樟芝泛醌类活性成分的诱导作用
将牛樟芝菌株S-29制备种子液，按照15％接种量将种子液接入发酵培养基中，培养温度28℃，转速150r/min，通气量1.2v/(v.m)。在发酵第3d，向发酵液中加入0.3g/L的2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物和20％(v/v)亚麻籽油，继续发酵7d。发酵结束后，收集菌体，测定菌体量以及泛醌类活性成分含量。
在此条件下，牛樟芝菌株S-29发酵菌体量为15.63g/L。牛樟芝菌体中诱导出泛醌类活性成分，其中，Antroquinonol含量达到277.48mg/L。
实施例的作用与效果
由实施例1至实施例3可知，采用本发明的制备方法制备得到的2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物的产率较高，当硼氢化钠与2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的摩尔比为3:1时，其产率最高达到了88％。
由实施例4至实施例10可知，采用本发明的2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物诱导牛樟芝泛醌类活性成分时，Antroquinonol含量均较高，常规液态发酵条件下能够达到58.27mg/L，添加石蜡油溶剂发酵后，产量高达238.57mg/L，远远超过了辅酶Q0的诱导效果。
因此，本发明的2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物的制备方法简单、成本低、产率高、容易实现工业化生产。另外，本发明的2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物作为前体物，能够高效的诱导牛樟芝合成泛醌类活性成分，其诱导效果要高于已报到的辅酶Q0，极大的提高了牛樟芝泛醌类活性成分的产量。并且，2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物的添加对牛樟芝菌体生长没有抑制作用。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。
