具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实验材料和方法：

实验仪器：熔点测定采用巩义市科瑞仪器有限公司的X-5型熔点测定仪。紫外图谱测定采用上海元析有限公司的UV-5500(PC)型紫外可见分光光度计。核磁共振¹H and 2DNMR谱(400MHz)、¹³C NMR谱(100MHz)采用Bruker AVANCEDⅢ400NMR仪，氘代试剂为CDCl₃或CD₃OD。化学位移值参考氘代试剂峰(CDCl₃为7.26/77.23，CD₃OD为3.31/49.15)。旋光度测量采用WZZ-2S型自动旋光仪(上海申光仪器有限公司)，溶剂为甲醇。高分辨质谱HRESI MS采用Orbitrap FusionTM TribridTM质谱仪(赛默飞)。低分辨质谱为APITOF-5000型质谱仪(禾信质谱，中国)。单晶衍射图采用XtaLAB PRO MM007HF型衍射仪(Rigaku)，采用铜钯(CuKα)。

统计学分析：数据直方图均采用prism 5软件进行统计分析，两组比较采用t-test和多组间比较采用单向方差分析(one-way ANOVA)的Tukey-Kramer进行显著性检验统计，P<0.05时具有统计学意义；qRT-PCR的实验数据运用ABI7500PCR分析软件进行分析，通过Prism5作图。

菌株：XM17菌株于2013年采集自广东省广州市动物园，于清晨动物园开园前，采集新鲜的熊猫(Ailuropoda melanoleuca)粪便，从粪便内部取样，经逐级稀释后，多次分离纯化后得到。该菌株的菌丝体白色，在固体培养基中为分散点状。经广州艾基生物技术有限公司16S rRNA基因测序后，鉴定为链霉菌属Streptomyces sp，菌株保藏在-80℃甘油冻存液中，保存在南方医科大学药学院多肽与天然产物研究组。

菌株培养和提取：首先将菌株XM17从-80℃冻存管中取出，置于含32#培养基制成的培养皿中复苏。待菌株生长良好后，转接到装有50mL 302#培养基的三角瓶(250mL)中，放置在摇床中振荡培养2天(200rpm，28℃)。然后，将种子培养液加入到含有500mL 400#培养基的三角瓶(2L)中，置摇床中振荡培养7天(200rpm，28℃)。

采用上述方法，共计培养了28L发酵液。将菌丝体和菌液分离。菌丝体采用等体积的95％乙醇浸泡三次，合并浸泡液，减压干燥后用纯水充分分散，再用等体积二氯甲烷和乙酸乙酯各萃取三次，合并萃取液后减压干燥。菌液流经D-101大孔树脂柱，先用大量纯水洗脱，然后用95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，合并后减压干燥，同样采用等体积二氯甲烷和乙酸乙酯各萃取三次。二氯甲烷和乙酸乙酯萃取液合并后进行下一步分离，共计得到7.1g黑褐色浸膏。

其中，32#培养基成分为葡萄糖4g/L，酵母膏4g/L，麦芽浸粉5g/L，微量盐(1mL微量盐溶液/1L培养基)，琼脂20g/L，1mol/L NaOH调PH为7.0；302培养基成分为可溶性淀粉20g/L；葡萄糖10g/L；蛋白胨10g/L；牛肉膏10g/L；酵母膏5g/L；CaCO₃ 10g/L，1mol/L NaOH调PH为7.0；400培养基成分为甘露醇30g/L；葡萄糖10g/L；酵母膏5g/L；枸橼酸钠1g/L；MgSO₄0.5g/L；K2HPO₄ 0.5g/L；微量盐(1mL微量盐溶液/1L发酵液)，1mol/L NaOH调PH为7.5；微量盐成分为FeSO₄·7H₂O 0.2％，MnCl₂·2H₂O 0.1％，ZnSO₄·7H₂O 0.1％，溶于纯水配制而成。

化合物分离纯化：提取物(7.1g)用少量甲醇和二氯甲烷完全溶解，在通风橱内与5.5g200～300目硅胶拌样，待干燥后装柱。200～300目硅胶55g用石油醚搅拌后，装硅胶柱(30cm×3.5cm，，柱体积约150mL)。将拌样的硅胶装柱后，采用梯度洗脱(石油醚：乙酸乙酯15:1～0:1；二氯甲烷：甲醇9:1～1:1)的方法洗脱，洗脱液经TLC检查，相似的馏分合并后减压干燥，得到13个组分(Fr.1-Fr.13)。Fr.3(260mg)用甲醇完全溶解后用Sephadex LH-20分离，100％甲醇洗脱，得到5个主要组分。Fr.3-5(75mg)进一步用硅胶柱(1cm×35mm，石油醚：乙酸乙酯15:1～1:1)纯化得到2个组分，Fr.3-5-1(11mg)经反相C-18柱(2cm×35cm)分离，采用60％甲醇/水溶液洗脱，得到化合物3(2.32mg)；Fr.3-5-2(6.6mg)经反相C-18柱(2cm×35cm)分离，采用60％甲醇/水溶液洗脱，得到化合物7(1.9mg)。

Fr.4(267mg)用甲醇完全溶解后用Sephadex LH-20柱分离，100％甲醇洗脱，得到5个主要组分。Fr.4-2(95mg)进一步才用硅胶柱(1cm×35mm，石油醚：乙酸乙酯12:1～1:1)纯化得到九个组分，Fr.4-2-5(17.73mg)为白色固体，经反相C-18柱(2cm×35cm)分离，采用80％甲醇/水溶液洗脱，得到化合物14(1.0mg)，13(9.1mg)。Fr.4-3(95mg)进一步才用硅胶柱(1cm×35mm，石油醚：乙酸乙酯10:1～1:1)纯化得到五个组分，Fr.4-3-3(10.24mg)经反相C-18柱分离(55％甲醇/水)洗脱两次，得到化合物10(4.3mg)；Fr.4-3-4(9.56mg)经反相C-18柱分离(55％甲醇/水)洗脱两次，得到化合物8(3.2mg)；Fr.4-3-5(17.17mg)经反相C-18柱分离(50％甲醇/水)洗脱两次，得到化合物5(4.8mg)，9(3.2mg)。

Fr.5(775mg)用甲醇完全溶解后用Sephadex LH-20分离，100％甲醇洗脱，得到7个主要组分。Fr.5-2(140mg)经反相C-18柱(2cm×35cm)分离，采用50％甲醇/水溶液洗脱，得到6个组分，Fr.5-2-5(50mg)用C-18制备柱(2.5cm×35mm，50％甲醇/水)纯化得到化合物6(3.5mg)。

Fr.6(472mg)用甲醇完全溶解后用Sephadex LH-20分离，100％甲醇洗脱，得到5个主要组分。Fr.6-3(55.3mg)进一步用硅胶柱(1cm×35mm，二氯甲烷：乙酸乙酯3.5:1)纯化得到6个组分，Fr.6-3-3(17.5mg)经反相C-18柱(2cm×35cm)分离，采用40％～60％甲醇/水溶液洗脱，得到化合物4(1.9mg)。

Fr.7(232mg)用甲醇完全溶解后用Sephadex LH-20分离，100％甲醇洗脱，得到6个主要组分。Fr.7-2(102mg)进一步用硅胶柱(1cm×35mm，石油醚：乙酸乙酯1:1，二氯甲烷：乙酸乙酯4:1)纯化得到6个组分，Fr.7-2-1(43mg)经反相C-18柱(2cm×35cm)分离，采用60％～100％甲醇/水溶液洗脱，得到化合物6个组分，Fr.7-2-1-3(7.2mg)经反相C-18柱(2cm×35cm)分离，采用40％甲醇/水溶液洗脱，得到化合物1(3.3mg)。

Fr.8(308mg)用甲醇完全溶解后用Sephadex LH-20分离，100％甲醇洗脱，得到7个主要组分。Fr.8-5(31mg)进一步用硅胶柱(1cm×35mm，二氯甲烷：乙酸乙酯50:1～15:1)纯化得到10个组分。Fr.8-5-7(5mg)经反相C-18柱(2cm×35cm)分离，采用60％～100％甲醇/水溶液洗脱，得到2(2.29mg)。

同时，化合物10也在Streptomyces sp HTL 16的培养液中分离得到。

细胞培养：MDCK细胞株由本实验室液氮保存，细胞复苏之后，经传两代至三代后用于实验。该细胞用含有100U/ml青/链霉素以及10％南美胎牛血清(FBS)的高糖培养基DMEM培养基培养，放置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱内培养生长，长满T25细胞培养瓶后按1：4的比例进行传代培养并记录好代数。

病毒株：甲型流感病毒A/Puerto/8/34(H1N1)和A/Aichi/2/68(H3N2)病毒株采用9日龄SPF级鸡胚尿囊液扩增，由本实验室-80℃保存。

MTT法测定化合物对MDCK细胞毒性：把处于对数生长期的MDCK细胞用含0.25％胰酶消化后，以每孔2×10⁴接种于96孔板中，放入温度为37℃，5％CO₂培养箱中过夜。弃去上清液，加入不同系列浓度的化合物(溶解于DMSO的化合物用DMEM基础培养液稀释，确保DMSO最终含量≤5‰)，并设溶剂对照组(含5‰DMSO的基础培养液，不含药物)和空白对照组(基础培养液，不含药物)，细胞继续置于培养箱内培养48h后，弃去上清液，每孔加入100μL MTT(0.5mg/mL)，避光孵育4h。培养终止后，小心吸去上清液，加入150μL DMSO溶解培养生成的甲瓒结晶，在低速振荡器上振荡10min，使其充分溶解。用酶标检测仪检测570nm波长处OD值，计算细胞存活率。

细胞存活率(％)＝[A_570nm]药物组/[A_570nm]空白组×100％。

病毒滴度的测定：MDCK细胞接种于96孔板，细胞密度为2×10⁴个细胞/孔，在5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养18～22h，待细胞长至单层，弃去上清液，PBS洗2次，每孔加入100μL用DMEM 10倍比稀释的流感病毒，病毒稀释浓度为10^-2～10^-8，每一浓度设置8个复孔，同时设置细胞对照组，即不加流感病毒对照组。加入病毒的细胞放于培养箱中孵育1h后弃去病毒液，PBS洗2次，每孔加入200μL细胞维持液(含1μg/mL TPCK胰酶的DMEM)继续培养48h。显微镜下观察细胞形态。等细胞出现萎缩，变圆，脱落等病变现象(细胞病变效应，CPE)时，记录CPE产生情况，根据Reed-Muench两氏法计算病毒对MDCK细胞的TCID₅₀。公式如下：

距离比例＝(高于50％病变率-50％)/(高于50％病变率-低于50％病变率)；

TCID₅₀＝高于50％病变率的病毒稀释对数+距离比例；

抗流感病毒活性IC₅₀测定：MDCK细胞接种于96孔板，2×10⁴个细胞/孔，在5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养18～22h，待细胞长至单层，弃去上清液，PBS洗2次。采用预处理病毒模式(Pretreatment of virus)测定化合物抗流感病毒活性测定：100TCID₅₀的病毒稀释液与等量梯度稀释的化合物混合均匀后37℃孵育30min；将病毒-化合物混合液加入已用PBS洗净的细胞中，100μL每孔，培养箱中孵育1h；去除混合液，PBS洗两次，加入200μL含1μg/mL TPCK胰酶的DMEM培养液继续培养48h。48h后弃去上清，加入MTT(0.5mg/mL)，100μL/孔，混匀，避光孵育4h。培养终止后，弃去上清液，加入150μL DMSO溶解培养生成的甲瓒结晶，并置于低速振荡器上振荡10min，使其充分溶解。于570nm波长下用酶标检测仪检测其OD值，计算细胞存活率。

荧光实时定量PCR：MDCK细胞接种于6孔板，2×10⁵个细胞/孔，在5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养18～22h，待细胞长至单层，弃去上清液，PBS洗2次。采用预处理病毒模式(Pretreatment of virus)测定化合物对HA表达的影响:100TCID₅₀的病毒液分别与3号化合物(5ng/mL和1ng/mL)、14号化合物(5ng/mL和1ng/mL)、阳性对照(阿比朵)(5μg/mL和1μg/mL)混合均匀后在37℃孵育30min后加入已用PBS洗净的细胞中，1mL每孔，培养箱中孵育1h；去除上清液，PBS洗两次，加入1mL含1μg/mL TPCK胰酶的DMEM培养液继续培养24h。

提取RNA：24h后弃去上清，用Trizol法提取细胞RNA。具体操作如下：弃去培养基，用PBS洗两遍，每孔加入1mL Trizol，静置5min，用枪头轻轻吹打转移到1.5mL离心管中，加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温下静置10min，12000g/min低温离心15min，此时溶液分为三层，小心吸取上层相(约0.4mL)转移至另一干净EP管中，加入等量异丙醇，上下颠倒混匀后室温静置10min，以12000g/min低温离心10min，弃去上清液，加入现配的1mL 75％乙醇，7500g/min低温离心10min，弃去上清液，室温下干燥沉淀，加入30-50μL DEPC水溶解沉淀，用微量紫外分光光度计测量mRNA的浓度和纯度，mRNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8～2.0范围内可用于后续实验。

逆转录：按照PrimeScript RT试剂盒说明书进行操作，逆转录体系为20μL，在2720Thermal Cycler PCR仪中反应，程序设置如下：第一步：37℃维持15min；85℃，维持5s；4℃，维持60min。

荧光定量PCR实验：按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书进行操作，扩增体系为10μL，仪器ABI7500PCR(Applied Biosystems,US)仪中进行，根据仪器说明，设置参数如下：第一步：95℃，30s，1个循环；第二步：94℃，5s，60℃，34s，40个循环；第三步：溶解曲线。通过ABI7500PCR分析软件进行分析，计算出所有样品的CT值，然后通过复孔的CT值来求样品的平均CT值，以GAPDH基因作为内参基因进行归一，用2^-△△CT法计数各个实验组的基因的相对表达量，然后通过Prism5作图。

HA正向引物：5'-TTCCCAAGATCCATCCGGCAA-3'(SEQ ID NO：1)；

HA反向引物：5'-CCTGCTCGAAGACAGC CACAACG-3'(SEQ ID NO：2)。

GAPDH正向引物：5'-AGGGCAATGCCAGCCCCAGCG-3'(SEQ ID NO：3)；

GAPDH反向引物：5'-AGGCGTCGGAGGGCCCCCTC-3'(SEQ ID NO：4)。

实验结果：

(1)化合物的分离和纯化

Streptomyces sp XM17是从广州动物园的健康大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)的新鲜粪便中分离得到。从该菌株的发酵液的乙酸乙酯提取物中分离得到了14个倍半萜类化合物，分别为：(2R,4S,8aR)-8,8a,1,2,3,4-hexahydro-2-hydroxy-4,8a-dimethyl-2(2H)-naphthalenone(1)；(1S,3S,4S,4aS,8aR)-4,8a-dimethyloctahydronaphthalene-1,3,4a(3H)-triol(2)；(4S,4aS,8aS)-octahydro-4a-hydroxy-4,8a-dimethyl-1(2H)-naphthalenone(3)；ganodermanol L(4)；and 4α,15-epoxy-eudesmane-1β,6α,11-triol(5)；cybullol(6)；(3β,4β,4aβ,8aα)-4,8a-dimethyl-octahydronaphthalene-3,4a(2H)-diol(7)；(1S,4S,4aS,8aR)-4,8a-dimethyloctahydronaphthalene-1,4a(2H)-diol(8)；(4β,4aβ,8α,8aα)-4,8a-dimethyloctahydronaphthalene-4a,8(2H)-diol(9)；(2α,4β,4aβ,8aα)-4,8a-dimethyloctahydronaphthalene-2,4a(2H)-diol(10)；(1β,4β,4aβ,8aα)-4,8a-dimethyloctahydronaphthalene-1,4a(2H)-diol(11)；eudesm-1β,6α,11-triol(12)，rel-(+)-(2aR,5S,5aR,8S,8aS,8bR)-decahydro-2,2,5,8-tetramethyl-2H-naphtho[1,8-bc]furan-5-ol(13)；caryolane-1,7α-diol(14)。采用了单晶衍射(X-ray)、核磁共振(一维及二维谱)等多种广谱学手段，分析了新化合物1-14的化学结构，分别如下所示：

1：白色针状物。mp 265.5-267.0℃.(c＝0.013MeOH).UV(MeOH)λ_max(logε)212(3.39),233(3.57)nm.ECD(MeOH)λ_max(Δε),201(+11.46),233(+29.93)nm.¹H和¹³C NMR数据，见表1。HRESIMS m/z 217.1201[M+Na]⁺(理论值C₁₂H₁₈O₂Na 217.1199)。

2：白色针状物。mp 167.0-168.2℃.(c＝0.015MeOH).¹H和¹³C NMR数据，见表1。HRESIMS m/z 237.1466[M+Na]⁺(理论值C₁₂H₂₂O₃Na 237.1461).X单晶衍射图见图3。

3：白色针状物。mp 110.7-111.4℃.(c＝0.02MeOH).¹H和¹³C NMR数据，见表1。ESIMS m/z 219.15[M+Na]⁺.HRESIMS m/z 219.1359[M+Na]⁺(理论值C₁₂H₂₀O₂Na219.1356).X单晶衍射图见图3。

4：白色针状物。mp 172.9-176.1℃.(c＝0.019MeOH).¹H和¹³C NMR数据，见表2。HRESIMS m/z 277.1780[M+Na]⁺(理论值C₁₅H₂₆O₃Na 277.1774).Single-crystalX单晶衍射图见图3。

5：无色油状。(c＝0.014MeOH).¹H和¹³C NMR数据，见表2.HRESIMS m/z 293.1725[M+Na]⁺(理论值C₁₅H₂₆O₄Na 293.1723)。

化合物1为无色针状物，其高分辨质谱HRESI MS为m/z 217.1201[M+Na]⁺，C₁₂H₁₈O₂Na理论计算值为217.1199，结合碳氢谱数据，确定其分子式为C₁₂H₁₈O₂，不饱和度Ω＝4。¹H NMR数据显示，化合物1含2个甲基信号，1个单峰甲基氢质子信号1.26，1个分裂为双峰的甲基氢质子信号δ_H 1.14，1个连氧的次甲基信号4.11，1个分裂为双峰的次甲基信号δ_H5.82，¹³C NMR和DEPT谱显示，化合物1含12个碳原子，包括3个季碳，3个次甲基碳，4个亚甲基碳，2个甲基碳信号。

¹H-¹H COSY谱显示，H-1(δ1.99及1.31)与H-2(δ4.11)，H-2与H-3(δ2.17及1.19)，H-3与H-4(δ2.48)，H-4与H-10(δ1.14)，H-7(δ2.52)与H-8(δ1.89)存在相关关系。HMBC谱显示H-9(δ1.26)与C-1(δ50.4)、C-8a(δ37.2)、C-4a(δ171.0)、以及C-8(δ24.0)存在相关关系，提示一个甲基(C-9,δ24.0)连接于C-8a。HMBC谱显示H-5(δ5.82)与C-4(δ32.8)、C-8a，H-7(δ2.52及2.35)与C-8a、C-6(δ200.0)，H-8(δ1.89)与C-1,C-4a,C-8,C-8a存在相关关系，结合上述谱图相关关系，可推导出部分化合物结构。同时，HMBC谱显示H-1与C-2(δ66.2)、C-3(δ44.8)、C-8a、C-9，H-3与C-1、C-2、C-4a、C-10(δ18.0)，以及H-4与C-8a，H-10与C-4a、C-3、C-4存在相关关系，进一步可验证化合物1的部分结构。经过上述对于化合物1的一维以及二维核磁共振波谱的推导，可推导出化合物1应为倍半萜类化合物。

从图1可以看出，NOESY谱显示H-2与H-4，H-2与H-9，H-4与H-9存在远程相关关系，提示H-2，H-4，及H-8a为cis-构型。同时，H-1(δ1.99,dt,J＝4.08,12.44Hz；δ1.31,br t,J＝12.12Hz)，H-2(δ4.11,br tt,J＝4.30,11.28Hz)的质子偶合常数提示2-位含一个羟基信号。化合物1具有α,β-不饱和环己烯酮的结构骨架，据文献报道，这种骨架由于其特定的立体结构而具有一定特征的旋光性(CD)。因此，化合物1的绝对立体结构可通过CD谱，测定其在220-260nm波长处的π→π*跃迁信号进行推导。图2可以看出，与已知化合物(4aS,5R)-4,4a,5,6,7,8-Hexahydro-5-hydroxy-4a-methyl-2(3H)-naphthalenone相比较，化合物1在235nm处显示出正克顿效应(Cotton Effect)，提示该化合物8a位手性碳原子应为R构型。这一结构也与文献报道的数据相一致。因此，推断化合物1的结构应为(2R,4S,8aR)-8,8a,1,2,3,4-hexahydro-2-hydroxy-4,8a-dimethyl-2(2H)-naphthalenone。

化合物2为无色针状物。化合物2的高分辨质谱显示分子离子峰为m/z 237.1466[M+Na]⁺(C₁₂H₂₂O₃Na理论计算值为237.1461)，提示该化合物的化学结构式为C₁₂H₂₂O₃，不饱和度为2。¹H NMR谱数据显示，化合物2含2个甲基信号，包括1个单峰信号δ0.94及1个双峰信号δ1.02；2个含连氧基团的次甲基氢质子信号δ3.97及δ3.86。¹³C NMR及DEPT谱数据显示，化合物2含12个碳原子信号，包括2个季碳(其中1个连羟基)，3个次甲基碳(其中两个连羟基)，5个亚甲基碳，以及两个甲基碳信号。

表1化合物1-3的¹H及¹³C NMR谱数据

^ain CDCl₃；^bin CD₃OD；^c400MHz,δin ppm；^d100 MHz,δin ppm；^e这些数据部分重叠。

¹H-¹H COSY数据显示，H-1(δ3.97)与H-2(δ1.97及1.85)，H-2与H-3(δ3.86)，H-3与H-4(δ1.71)存在相关关系。HMBC谱显示，H-1与C-2(δ39.1)、C-8(δ31.8)、C-8a(δ44.0)、C-9(δ14.4)；H-2与C-1(δ70.5)、C-3(δ74.8)、C-4(δ37.5)、C-8a；H-3与C-1、C-2、C-4、C-4a(δ79.5)、C-10(δ12.0)；以及H-4与C-3、C-4a、C-8a、C-5(δ21.5)、C-10存在相关关系(图1)。HMBC谱还显示H-9(δ0.94)与C-1、C-4a、C-8、C-8a；H-10(δ1.02)与C-3、C-4、C-4a相关。同时，¹H-¹H COSY显示H-4与H-10存在相关关系。因此，综合以上谱图数据，推导出化合物2的平面结构图与已知化合物geosmin相类似，不同之处在于，化合物2含有两个连羟基的次甲基碳信号(δ_C 70.5,δ_H 3.97andδ_C 74.8,δ_H 3.86)。综合以上的NMR实验数据，这两个羟基分别位于C-1和C-3的位置。通过测定化合物2的X单晶衍射图(图3)，Flack常数为[χ＝0.0(2)]，进一步确定了化学结构式以及其立体结构。因此，该化合物为(1S,3S,4S,4aS,8aR)-4,8a-dimethyloctahydronaphthalene-1,3,4a(3H)-triol。

化合物3为无色针状物。高分辨质谱HRESI MS显示该化合物的分子离子峰为m/z219.1359[M+Na]⁺(理论计算值为C₁₂H₂₀O₂Na 219.1356)，提示该化合物分子式为C₁₂H₂₀O₂，不饱和度为3。¹H NMR谱显示，化合物3含两个甲基信号，其中δ1.23(3H)为单峰，δ0.89(3H)为双峰；两个亚甲基氢质子信号δ2.72(1H)和δ2.23(1H)，二者均连氧；以及一个次甲基信号δ2.16(1H)(表1)。¹³C NMR和DEPT谱显示，化合物3含12个碳原子，其中，3个季碳(1个季碳连羟基，1个季碳连羰基)，1个叔碳，6个仲碳，以及2个甲基碳信号(表1)。

化合物3的HMBC谱显示，H-2(δ2.72及2.23)、H-3(δ1.78)、H-9(δ1.24)与羰基碳信号δ215.9存在相关关系，提示C-1为羰基碳。HMBC谱显示H-9与C-1、C-8a(δ52.0)、C-4a(δ78.0)、以及C-8(δ27.7)存在相关关系，提示C-9位的甲基连接于C-8a位的季碳上。因此，另外一个季碳(C-4a)应连接一个羟基。同时，HMBC谱还显示H-10(δ0.89)与C-4(δ33.8)、C-4a、以及C-3(δ29.9)相关，提示C-10,(δ14.5)与C-3、C-4及C-4a相连。¹H-¹H COSY谱中H-2与H-3、H-3与H-4(δ2.16)、H-4与H-10(δ0.89)相关，进一步验证了这个推断。因此，推导出化合物3的结构式如前文所示，应为倍半萜类化合物。

化合物3的相对构型可通过NOESY谱推导，并进一步根据X单晶衍射谱验证。通过该化合物的X单晶衍射图(图3)，Flack参数为[χ＝0.08(7)]，可知该化合物为(4S,4aS,8aS)-octahydro-4a-hydroxy-4,8a-dimethyl-1(2H)-naphthalenone。

化合物4为白色针状物。高分辨质谱HRESI MS显示该化合物的分子离子峰为m/z277.1780[M+Na]⁺(理论计算值为277.1774)，推测其分子式为C₁₅H₂₆O₃Na，不饱和度为3。¹HNMR谱显示，该化合物含4个甲基氢质子信号，包括3个单峰δ1.05(3H)及δ1.33(6H)，1个双峰δ0.96(3H)，2个连羟基的氢质子信号δ3.95(1H)和δ3.58(1H)，以及1个次甲基氢质子信号δ2.28(1H)。¹³C NMR和DEPT谱数据显示，4含15个碳信号，其中，2个季碳信号(1个连羟基)，6个次甲基碳信号(2个连羟基)，3个亚甲基信号，以及4个甲基信号(表2)。

化合物4的¹H-¹H COSY谱显示，H-1(δ3.95)与H-2(δ1.88及1.59)、H-10(δ1.45)相关，H-2与H-3(δ2.28)相关，H-3与H-4(δ3.58)、H-15(δ0.96)相关，H-4与H-5(δ1.29)相关，H-6(δ1.52及1.67)与H-7(δ1.22)相关，H-7与H-8(δ1.81及1.57)相关。HMBC谱显示，H-4与C-5(δ42.4)、C-6(δ52.3)、C-15(δ11.7)相关，H-12(δ1.05)与C-6、C-11(δ83.7)、C-13(δ29.2)相关，H-13(δ1.33)与C-6、C-11、C-12(δ24.8)相关，H-14(δ1.33)与C-8(δ42.8)、C-9(δ73.9)相关，H-15(δ0.96)与C-2(δ39.8)、C-3(δ31.3)、C-4(δ81.0)相关。这些数据可推导出化合物4与化合物13的化学结构相似，13是从地衣Ptychanthus striatus以及菌丝体Ganodermacapense的培养物中分离得到的一个已知化合物。两者最大的区别在于，化合物4多了一个羟基。经过对4的HMBC谱进行分析，发现H-1与C-2、C-5、C-9、C-10(δ53.8)相关，H-10与C-1(δ68.0)、C-2、C-4、C-5、C-9、C-14(δ22.3)相关，因此推测这个羟基位于C-1位。NOESY谱显示，H-1与H-14/15，H-4与H-6/13存在明显的远程相关关系，提示4与13的相对构象相似。进一步测定该化合物的X单晶衍射图，Flack常数为[χ＝0.06(8)]，确定化合物4的绝对构型为1S,3S,4S,5R,6R,9S,10R，化合物4命名为ganodermanol L。

表2化合物4-5的¹H and ¹³C NMR谱(氘代试剂为CDCl₃)

^a100 MHz,δ(ppm)；^b400 MHz,δ(ppm)；^c这些数据部分重叠。

化合物5为无色油状物。高分辨质谱HRESI MS显示该化合物的分子离子峰为m/z293.1725[M+Na]+(理论计算值C₁₅H₂₆O₄Na 293.1723)，提示该化合物的分子式为C₁₅H₂₆O₄，不饱和度为3。¹H NMR谱数据显示，化合物5含三个单峰甲基信号δ1.21(3H)、1.15(3H)、以及0.88(3H)，2个连氧的亚甲基氢质子信号δ3.23(1H)和2.82(1H)，2个连羟基的次甲基氢质子信号δ3.81(1H)和3.44(1H)。¹³C NMR and DEPT谱数据显示，5含15个碳信号，其中，3个季碳(两个连羟基)，4个次甲基碳(两个连羟基)，5个亚甲基(一个连羟基)，以及三个甲基碳信号(图1)。

化合物5的¹H-¹H COSY谱显示，H-1(δ3.44)与H-2(δ1.94及1.75)、H-2与H-3(δ2.10及1.33)、H-5(δ1.79)与H-6(δ3.91)、H-6与H-7(δ1.52)、H-7与H-8(δ1.68及1.11)相关。HMBC谱显示，H-1(δ3.44)与C-2(δ29.6)、C-5(δ49.3)、C-9(δ37.2)、C-10(δ42.2)、C-14(δ12.4)、H-15(δ3.23及2.82)与C-3(δ33.5)、C-4(δ62.1)、C-5、以及H-14(δ0.88)与C-1(δ78.2)、C-5、C-9、C-10相关。从这些谱图数据可以推导出化合物5与从小窃衣Torilis japonica的果实中分离得到的一个已知化合物4α,15-epoxyeudesmane-1β,6α-diol的化学结构相似。对5的HMBC谱进行仔细分析，发现H-12(δ1.21)与C-7、C-11、C-13(δ29.4)，以及H-13(δ1.15)与C-7、C-11、C-12(δ24.5)相关，因此，可以推导出这两个化合物最大的不同在于，化合物5在C-11位多了一个羟基结构。

NOESY谱显示，5的H-14与H-15/6，H-15与H-12/13存在远程相关关系，同时，H-1[δ3.44,dd(2.72,11.48)]，H-5[δ1.79,dd(2.72,6.76)]以及H-7[δ1.52,dd(4.00,9.92)]的偶合常数均与4α,15-epoxyeudesmane-1β,6α-diol相似，提示5的相对构型与这个已知化合物相似。因此，将5命名为4α,15-epoxyeudesmane-1β,6α,11-triol。

(2)抗病毒效果检测

采用“预处理病毒”模式，测定了化合物1-14对流感病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)和A/Aichi/2/68(H3N2)，以及新冠病毒SARS-CoV-2的抗病毒效果。结果见表3，可以看出，这些化合物在25μM范围内对SARS-CoV-2病毒株没有抑制活性，而在4.8～48.7nM范围内对流感病毒具有较强的抑制活性，提示这些化合物可能通过抑制流感病毒的进入，而在病毒感染的早期阶段发挥作用。同时，采用MTT法测定了这些化合物的细胞毒性，发现它们的细胞毒性范围在微摩尔级别，提示这些化合物的选择性指数大于500，显示出它们具有被进一步深入研究的潜力。

表3化合物1-14的抗病毒效果

^a对犬肾细胞(MDCK)的细胞毒性；^b influenza A/PR/8/34(H1N1)virus；^cinfluenza A/Aichi/2/68(H3N2)virus：^dμM.。

随后，任意选取了化合物3和14，利用RT-PCR进一步确认它们的抗流感病毒活性。结果如图4所示，当分别用化合物1ng/mL和5ng/mL的浓度预处理病毒后，RT-PCR实验观察到血凝素酶(HA)基因表达水平明显降低，进一步确认了它们的抗病毒活性。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 具有抗流感病毒活性的倍半萜类化合物及应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttcccaagat ccatccggca a 21

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctgctcgaa gacagccaca acg 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agggcaatgc cagccccagc g 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aggcgtcgga gggccccctc 20